Выращивание клеток вне организма. I

Зачатков органов, выращенные вне организма (in vitro). В основе выращивания клеток и тканей лежит строгое соблюдение стерильности и использование специальных питательных сред, обеспечивающих поддержание жизнедеятельности культивируемых клеток и максимально сходных со средой, с которой клетки взаимодействуют в организме. Метод получения культуры клеток и тканей является одним из важнейших в экспериментальной биологии. Культуры клеток и тканей могут быть заморожены и сохраняться длительное время при температуре жидкого азота (-196°С). Основополагающий эксперимент по культивированию клеток животных провёл американский учёный Р. Гаррисон в 1907 году, поместив кусочек зачатка нервной системы зародыша лягушки в сгусток лимфы. Клетки зачатка оставались живыми несколько недель, из них вырастали нервные волокна. Со временем метод был усовершенствован А. Каррелем (Франция), М. Берроузом (США), А. А. Максимовым (Россия) и другими учёными, использовавшими в качестве питательной среды плазму крови и вытяжку из тканей зародыша. В дальнейшем успехи в получении культуры клеток и тканей были связаны с разработкой сред определённого химического состава для культивирования различных типов клеток. Обычно они содержат соли, аминокислоты, витамины, глюкозу, факторы роста, антибиотики, предупреждающие заражение культуры бактериями и микроскопическими грибами. Начало созданию метода культуры клеток и тканей у растений (на кусочке флоэмы моркови) положено Ф. Стюардом (США) в 1958.

Для культивирования клеток животных и человека могут быть использованы клетки разного происхождения: эпителиальные (печень, лёгкие, молочная железа, кожа, мочевой пузырь, почка), соединительнотканные (фибробласты), скелетные (кость и хрящи), мышечные (скелетные, сердечная и гладкие мышцы), нервной системы (глиальные клетки и нейроны), железистые клетки, секретирующие гормоны (надпочечники, гипофиз, клетки островков Лангерганса), меланоциты и различные типы опухолевых клеток. Выделяют 2 направления их культивирования: культура клеток и органная культура (культура органов и тканей). Для получения культуры клеток - генетически однородной быстро пролиферирующей популяции - кусочки ткани (обычно около 1 мм 3) извлекают из организма, обрабатывают соответствующими ферментами (для разрушения межклеточных контактов) и образующуюся суспензию помещают в питательную среду. Культуры, полученные из эмбриональных тканей, характеризуются лучшей выживаемостью и более активным ростом (из-за низкого уровня дифференцировки и наличия стволовых клеток-предшественников в эмбрионах) по сравнению с соответствующими тканями, взятыми из взрослого организма. Нормальные ткани дают начало культурам с ограниченным временем жизни (так называемый предел Хейфлика), тогда как культуры, полученные из опухолей, способны пролиферировать неограниченно долгое время. Однако даже в культуре нормальных клеток некоторые клетки спонтанно иммортализуются, то есть становятся бессмертными. Они выживают и дают начало клеточным линиям с неограниченным сроком жизни. Исходно клеточная линия может быть получена из популяции клеток или из отдельной клетки. В последнем случае линию называют клоновой, или клоном. При длительном культивировании под воздействием различных факторов свойства нормальных клеток изменяются, происходит трансформация, основными признаками которой являются нарушения морфологии клеток, изменение числа хромосом (анеуплоидия). При высокой степени трансформации введение таких клеток животному может вызывать образование опухоли. В органной культуре сохраняются структурная организация ткани, межклеточные взаимодействия, поддерживается гистологическая и биохимическая дифференцировка. Ткани, зависимые от гормонов, сохраняют чувствительность к ним и характерные ответы, железистые клетки продолжают секретировать специфические гормоны и т.д. Такие культуры выращивают в культуральном сосуде на плотиках (бумажных, миллипоровых) или на металлической сетке, плавающих на поверхности питательной среды.

У растений культивирование клеток основано, в общем, на тех же принципах, что и у животных. Различия же в способах культивирования определяются структурными и биологическими особенностями клеток растений. Большинство клеток растительных тканей обладают тотипотентностью: из одной такой клетки при определённых условиях может развиться полноценное растение. Для получения культуры растительных клеток используется кусочек любой ткани (например, каллуса) или органа (корня, стебля, листа), в котором присутствуют живые клетки. Его помещают на питательную среду, содержащую минеральные соли, витамины, углеводы и фитогормоны (чаще всего цитокины и ауксины). Растительные культуры поддерживают при температурах от 22 до 27°С, в темноте или при освещении.

Культуры клеток и тканей находят широкое применение в разных областях биологии и медицины. Культивирование соматических клеток (все клетки органов и тканей за исключением половых) вне организма определило возможность развития новых способов изучения генетики высших организмов с использованием, наряду с методами классической генетики, методов молекулярной биологии. Наибольшее развитие получила молекулярная генетика соматических клеток млекопитающих, что связано с появившейся возможностью постановки прямых экспериментов с клетками человека. Культуру клеток и тканей используют при решении таких общебиологических проблем, как выяснение механизмов экспрессии генов, раннего эмбрионального развития, дифференцировки и пролиферации, взаимодействия ядра и цитоплазмы, клеток со средой, адаптации к различным химическим и физическим воздействиям, старения, злокачественной трансформации и др., её применяют для диагностики и лечения наследственных заболеваний. В качестве тест-объектов клеточные культуры являются альтернативой использованию животных при испытании новых фармакологических средств. Они необходимы при получении трансгенных растений, клонального размножения. Важную роль клеточные культуры играют в биотехнологии при создании гибридов, производстве вакцин и биологически активных веществ.

Смотри также Клеточная инженерия.

Лит.: Методы культивирования клеток. Л., 1988; Культура животных клеток. Методы / Под редакцией Р. Фрешни. М., 1989; Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М., 1991; Freshney R. I. Culture of animal cells: а manual of basic technique. 5th ed. Hoboken, 2005.

О. П. Кисурина-Евгеньева.

В зависимости от техники приготовления культуры клеток классифицируют на:

- однослойные – клетки способны прикрепляться и размножаться на поверхности химически нейтрального стекла или пластика.

- суспензионные – клетки размножаются во всем объеме питательной среды при ее перемешивании.

- органные - цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие исходную структуру вне организма (применение ограничено).

Наибольшее распространение имеют однослойные культуры клеток, которые можно разделить в зависимости от числа жизнеспособных генераций на

1) первичные (первично трипсинизированные),

2) полуперевиваемые (диплоидные)

3) перевиваемые.

По происхождению они классифицируются на эмбриональные, опухолевые и из взрослых организмов.

По морфогенезу - на фибробластные, эпителиальные и др.

Первичные культуры клеток - это клетки какой-либо ткани человека или животного, которые имеют способность расти в виде монослоя на пластмассовой или стеклянной поверхности, покрытой специальной питательной средой. Срок жизни таких культур ограничен. В каждом конкретном случае их получают из ткани после механического измельчения, обработки протеолитическими ферментами и стандартизации количества клеток. Первичные культуры, полученные из почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов, широко используются для выделения и накопления вирусов, а также для производства вирусных вакцин.

Полуперевиваемые (или диплоидные ) культуры клеток - клетки одного типа, способные in vitro выдерживать до 50-100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные штаммы фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных вакцин. Чаще всего используют культуры фибробластов эмбриона человека (WI-38, MRC-5, IMR-9), коров, свиней, овец и т.д.

Перевиваемые клеточные линии характеризуются потенциальным бессмертием и гетероплоидным кариотипом. Источником перевиваемых линий могут быть первичные клеточные культуры (например, СОЦ – сердце обезьяны цинамобус, ПЭС – почки эмбриона свиньи, ВНК-21 - из почек однодневных сирийских хомяков; ПМС - из почки морской свинки, Vero – почка зеленой обезьяны и др.) отдельные клетки которых обнаруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению из клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур - трансформированными. Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачественные новообразования . В этом случае трансформация клеток происходит in vivo. Наиболее часто в вирусологической практике применяются такие линии перевиваемых клеток: HeLa - получена из карциномы шейки матки; Нер-2 - из карциномы гортани; Детройт-6 - из метастаза рака лёгкого в костный мозг; RH - из почки человека, КВ – карцинома ротовой полости, RD – рабдомиосаркома человека.

Культуры органов – представляют собой приготовленные в стерильных условиях срезы органов животных, которые на протяжении определенного срока (дни, недели) сохраняют свою жизнедеятельность в особенных условиях культивирования

Клеточные культуры — это генетически однородные популяции клеток, растущих в постоянных условиях окружающей среды. Это могут быть штаммы нормальных клеток человека, животных, растений или тканей злокачественных опухолей.

Условия культивирования

Клетки обычно помещают в стеклянные сосуды, отсюда и исследования получили название изучение in vitro (от лат. In — в, vitro — стекло), хотя теперь чаще культуры выращивают в пластмассовых сосудах. Выделенные из тканей клетки инкубируют при температуре 38 ° C 39 ° C (для клеток животного и человеческого организмов) и при 22 ° C 28 ° C (для растительных клеток) в питательной среде соответствующего состава. Клетки тогда растут в виде суспензии или монослоя. Суспензионная культура — это выращивание отдельных клеток или небольших их групп во взвешенном состоянии в жидкой питательной среде с использованием аппаратуры, обеспечивающей их аэрацию и перемешивание. Характерной особенностью суспензионных культур является их морфологическая и биохимическая гетерогенность. Клеточная популяция содержит клетки, которые отличаются по размеру и форме.

Применение

Применение в цитологии

В цитологии данный метод удобен тем, что клетки в культуре легко доступны для различных биохимических манипуляций. При работе с ними радиоактивные вещества, яды, гормоны и др. могут быть введены в нужной концентрации в течение требуемого времени. Количество этих веществ может быть на порядок меньше, чем при эксперименте на животных. Исчезает угроза того, что вещество будет Метаболизированный печенью, экскретироваться почками или отложится в мышцах. Это обеспечивает получение реальных значений скорости действия вещества на клетку или ее усвоения клеткой.

Для исследования живых растительных клеток используют культуру изолированных протопластов. Изолированные протопласты можно определить как «голые» клетки растений, поскольку клеточная стенка удаляется механическим или ферментативным способом. Система изолированных протопластов дает возможность вести селекцию на клеточном уровне, работать в малом объеме с большим количеством индивидуальных клеток, получать новые формы растений путем прямого переноса генов, получать соматические гибриды между удаленными в систематическом отношении видами. Поскольку в изолированных протопластах сразу начинается регенерация клеточной оболочки, то они являются удобным объектом для изучения формирования целлюлозных микрофибрилл.

Применение в вирусологии

В вирусологии культуры клеток используются очень широко, поскольку с ними сравнительно легко работать в лаборатории, в отличие от других методов — выращивание вирусов на куриных эмбрионах или в организме живых животных. Кроме того, на монослое клеточной культуры можно хорошо изучить цитопатическое действие вирусов, по образованию внутри- клеточных включений, бляшек, в реакциях гемадсорбции и гемагглютинации и по цветовой пробоя. При работе с культурами клеток существенные результаты могут быть получены при работе с небольшим количеством культур. Эксперименты, которые требуют для подтверждения того или иного факта сотни или тысячи лабораторных животных могут быть с равным статистической достоверностью поставлены на таком же количестве культур клеток. Таким образом при лаборатории не надо держать виварий и отсутствуют этические аспекты обращения с больными животными.

Также изучается трансформация клеток вирусами, механизм которой подобен механизму возникновения злокачественных опухолей.

Применение в фармакологии

Культуры клеток широко применяются для тестирования действия веществ, которые могут быть использованы в качестве лекарственных препаратов. Несмотря на то, что результаты, полученные на культурах клеток нельзя экстраполировать на весь организм, не вызывает сомнения, что если то или иное вещество нарушает деятельность клеток из нескольких разных линиях культур, то необходимо ожидать негативного эффекта и при введении этого вещества в организм.

Применение в биотехнологии

Специфические культуры клеток является ценным источником гормонов и других биологически активных веществ. Уже сейчас они применяются для производства противовирусного белка интерферона.

Применение в генетике

В генетике способность клеток к росту в культуре используется в следующих направлениях:

• Клонирование
• Хранение клеток
• Получение мутантных клеток и работа с ними

Типы культур клеток

1. Первично-трипсинизовани — получают из измельченных тканей человека и животных путем их обработки трипсином или другими ферментами. Выдерживают лишь 5-10 делений (пассажей).

2. перевиваемых — клетки, которые приобрели способность к безграничному размножению, поскольку являются производными опухолей человека и животных.

3. Напивперещеплювани (диплоидные) — могут выдерживать до 100 пассажей, сохраняя при этом исходный диплоидный набор хромосом.

Наиболее распространенные линии клеток

Тема 10. Использование в вирусологии культур клеток. Типы культур клеток

Контрольные вопросы

Задание к следующему занятию.

Подведение итогов занятия.

Задания

1. Подготовить куриные эмбрионы к заражению.

2. Заразить куриные эмбрионы вирусами ньюкаелской болезни и оспы голубей (кур).

3. Вскрыть зараженные куриные эмбрионы, получить ХАО и аллантоисную жидкость.

4. Поставить капельную РГА с аллантоисной жидкостью.

Самостоятельная работа студентов:

а) подготовка рабочих мест и спецодежды к вскрытию куриных эмбрионов, зараженных на предыдущем занятии;

б) вскрытие куриных эмбрионов, зараженных вирусом ньюкаслской болезни, отсасывание аллантоисной и амниотической жидкостей, постановка капельной РГА;

в) вскрытие куриных эмбрионов, зараженных вирусом оспы, извлечение ХАО, подсчет и зарисовка оспин;

г) подготовка к обеззараживанию инструментов, эмбрионов, посуды.

1. Что вы знаете о методах индикации вирусов в куриных эмбрионах?

2. Какие способы получения вируссодержащего материала от куриных эмбрионов вы знаете?

3. Каковы гемагглютинирующие свойства вирусов и их использование? Каков механизм гемагглютинации?

Цель занятия: изучить различные виды культур, их номенклатуру. Изучить материальное обеспечение при производстве клеточных культур.

Оборудование и материалы: растворы Хенкса. Эрла, питательная среда 199, Игла, гидролизат лактальбумина, матрасы, флаконы, стеклянная посуда, готовые культуры клеток, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.

Объяснение преподавателя. Выращивание культур клеток для получения различных биологических про­дуктов, проведения научно-исследовательских или диагностических работ явля­ется революционизирующим моментом XX в. Признание идеи о том, что клетки тканей высших животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro, датируется первым десятилетием XX в. После того как стало известно, что подобные процессы реальны, наступил вто­рой этап работ – выращивание клеток и репродукция в них вирусов. Третий и четвертый этапы начинаются с появлением возможности вставить в клетки экзогенно полученные гены и получить их экспрессию и подтверждения возмож­ности выращивания из одиночной клетки целой популяции (гибридом что знаменуют собой возможность получения трансгенных систем и клонирования организмов. В настоящее время ни одна вирусологическая лаборатория не может обойтись без культуры клеток. Культуры клеток имеют следующие преимущества перед лабораторными животными и куриными эмбрионами:

можно добиться заражения практически всех культур клеток, что позволяет получать вируссодержащий материал с наивысшей концентрацией вируса при наименьшем содержании белкового балласта;

поскольку можно получить культуры клеток любого вида животного, снимаются видовые ограничения культивирования вирусов;

возможно вмешательство в инфекционный процесс в любой момент, не нарушая целостности живой системы;

можно непрерывно контролировать ход инфекционного процесса;

возможно получение готовой суспензии вируса в виде культуральной жидкости;

соблюдается полная стерильность культуральном жидкости в отношении грибов и бактерий;

предельно просты техника заражения и получение вируссодержащего материала;

относительная дешевизна.

Культуры клеток – наиболее совершенная из лабораторных система для культивирования вирусов. В вирусологической практике культуры клеток чаще всего используют для первичного обнаружения вирусов и их выделения из патологического материала, накопления вируса при изготовлении вакцин и диагностикумов, поддержания вирусных штаммов в лаборатории, титрования вирусов и как тест-объект в реакции нейтрализации.

Для успешного выделения вируса необходимо соблюдать следующие требования:

используемая культура клеток должна быть чувствительной к предполагаемому вирусу. Чувствительность ее повышается, если клетки получены от молодых животных (лучше эмбрионов);

10.1 Типы культур клеток. Культура клеток – это клетки многоклеточного организма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма (in vitro).

Методика культивирования клеток особенно успешно стала развиваться после 40-х годов текущего столетия. Этому способствовали следующие обстоятельства: открытие антибиотиков, предотвращающих бактериальное заражение культур клеток, открытие Хуангом (1943) и Эндерсом (1949) способности вирусов вызывать специфическую деструкцию клеток (цитопатический эффект) – удобный метод индикации вирусов в культурах клеток, и, наконец, Дульбекко и Фогт (1952) предложили методику трипсинизации тканей и получения однослойных культур клеток.

В вирусологической практике применяют следующие культуры клеток.

Первично-трипсинизированные культуры клеток – клетки, полученные непосредственно из органов или тканей организма, растущие in vitro в один слой (рис. 26). Культуру клеток можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного (взрослого или эмбриона). Однако лучше это удается сделать из эмбриональных органов, так как клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для этих целей используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы эмбрионов или молодых животных.

Рисунок 26. Первичная культура клеток легких эмбриона овцы (по Троценко Н.И. и др.)

Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2-3 ч после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают их на кусочки (1-4 мм) и обрабатывают ферментами: трипсином, панкреатином, коллагеназой и другими (чаще трипсином). Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37 °С.

Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делиться. В развитии культур клеток различают несколько фаз: адаптации, логарифмического роста, стационарную и старения (гибель клеток). Размножаясь, клетки размещаются на поверхности стекла и при полном покрытии его в один слой контактируют друг с другом и прекращают делиться (контактная ингибиция). На стекле формируется слой толщиной в одну клетку (поэтому эти культуры клеток называют однослойными или монослойными).

Обычно монослой формируется через 3–5 дней. Скорость его формирования зависит от вида ткани, возраста животного, качества питательной среды, посевной концентрации клеток и других факторов.

Питательную среду меняют по мере загрязнения ее продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохраняет жизнеспособность в течение 7–21 дня (в зависимости от вида клеток и состава питательной среды).

Интенсивность размножения клеток и состояние монослоя контролируют визуально под малым увеличением микроскопа (объектив х10). Лучше для этой цели использовать инвертированный микроскоп.

Для культивирования вирусов используют молодые культуры клеток (как только сформировался монослой).

Субкультуры. В вирусологической практике часто используют субкультуры, которые получают из первичных клеток, выращенных в матрасах, путем снятия их со стекла раствором версена или трипсина, ресуспендирования в новой питательной среде и пересева на новые матрасы или пробирки. Через 2–3 сут формируется монослой.

Практически субкультуру можно получить из всех первичных культур клеток. (Хуже субкультивируются куриные фибробласты.) Субкультуры по чувствительности к вирусам не уступают первичным культурам клеток, кроме того, они более экономичны, и есть возможность выявления контаминации клеток вирусами. Субкультуры получают от 2–5 пассажей (перевивок) и очень редко до 8–10. Последующие пассажи приводят к изменению морфологии клеток и их гибели.

Если клеточные культуры прошли более 10 пассажей, они уже на стадии перехода к перевиваемым культурам клеток.

Перевиваемые культуры клеток – это клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лабораториях их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в другой (при условии замены питательной среды).

Получают перевиваемые клетки из первичных культур клеток с повышенной активностью роста путем длительных пересевов в определенном режиме культивирования. Обычно работа по получению новых клеточных линий продолжается несколько месяцев. Полагают, что механизм происхождения перевиваемых культур клеток – результат генетической изменчивости клеток или селекции единичных клеток, присутствующих в первичной исходной культуре.

Клетки перевиваемых культур имеют одинаковую форму, гетероплоидный набор хромосом (у первичных клеток он диплоидный), стабильны в условиях роста in vitro, некоторые из них обладают онкогенной активностью. Последнее свойство ограничивает использование перевиваемых культур клеток для культивирования вирусов при производстве вакцин.

Перевиваемые культуры клеток можно получать как из здоровых тканей животных, так и из опухолевых. Среди них наиболее широко используют следующие линии клеток: HeLa (из раковой опухоли шейки матки женщины); Нер-2 (из карциономы гортани человека); KB (из раковой опухоли полости рта); ВНК-21 (почка новорожденного хомячка); ППЭС (перевиваемая почка эмбриона свиньи); ППТ (перевиваемая почка теленка); ППО (перевиваемая почка овцы); TR (из слизистой трахеи коровы); L (мышиные фибробласты); СОЦ (из сердца обезьяны циномольгус) и др.

Перевиваемые клетки имеют преимущества перед первичными: их приготовление значительно проще, экономятся труд и материальные средства; эти культуры заранее можно проверить на наличие латентных вирусов и микрофлоры; клональные линии обеспечивают более стандартные условия для размножения вирусов, чем первичные, представляющие смешанную популяцию клеток. Большинство перевиваемых клеток обладает более широким спектром чувствительности к вирусам, чем соответствующие первичные культуры.

Однако перевиваемые клетки имеют и недостатки: они склонны к малигнизации, т. е. злокачественное перерождение независимо отпроисхождения и снижения чувствительности к вирусам у них происходит быстрее, чем у первичных, поэтому необходимо применять клональные линии перевиваемых клеток.

Поддерживают перевиваемые клетки путем периодических пересевов. Чаще используют бесцентрифужный метод. Для очередного пересева отбирают 2–3-дневную культуру с хорошим монослоем, сливают питательную среду, а клеточный монослой покрывают подогретым до 35-37°С 0,02%-ным раствором версена. Диспергирующее действие версена объясняется связыванием им двухвалентных катионов (Mg ++ , Ca ++), которые способствуют прикреплению клеток к стеклу и обеспечивают целостность клеточной культуры. Под действием версена клетки округляются, отделяются от стекла.

Через 10–15 мин после округления клеток версен сливают, оставляя небольшое количество его (в 1-литровом матрасе – 5-–10 мл, в 0,1-литровом – 2–3 мл), и выдерживают еще 5–10 мин, периодически омывая клетки версеном, затем добавляют небольшое количество питательной среды. После встряхивания подсчитывают клетки в камере Горяева, исходную клеточную взвесь разводят ростовой питательной средой до необходимой концентрации (80–200 тыс. в 1 мл) и разливают при помешивании в пробирки или матрасы, закрывают резиновыми пробками и культивируют в термостате при 37 °С в течение 3–4 дней до образования сплошного монослоя. Обычно клетки в камере Горяева не подсчитывают, а пересевают с коэффициентом от 1:2 до 1:6 в зависимости от вида клеток. Состав питательной среды также зависит от вида клеток, но чаще при культивировании перевиваемых клеток используют среды Игла, 199 или смеси этих сред с гидролизатом лактальбумина.

Важно отметить, что при поддержании перевиваемых клеток путем их систематического пересева в лаборатории оставляют не менее одного матраса без пересева на случай непригодности последнего пассажа.

Диплоидные культуры клеток. Международный комитет по клеточным культурам дал следующее определение диплоидным клеткам: это морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая ограниченный срок жизни, характеризующаяся тремя фазами роста, сохраняющая в процессе пассирования кариотип, свойственный исходной ткани, свободная от контаминантов и не обладающая туморогенной активностью при трансплантации хомячкам.

Диплоидные культуры клеток, так же как и перевиваемые, получают из первичных культур клеток. Кариотип клеток очень лабилен и при обычных методах культивирования клеток он изменяется в первые дни. Поэтому потребовались специальные методы обработки ткани, высокого качества питательные среды, фетальная сыворотка для длительного поддерживания клеток in vitro в диплоидном состоянии. Эту задачу впервые успешно решили американские ученые Хейфлик и Мурхед (1961).

Диплоидные клетки получены из различных тканей эмбриона человека (легкие, почки, кожно-мышечная ткань, сердце и др.) и животных (почка эмбриона крупного рогатого скота, свиней, ВНК-21 – почка хомяка и др.).

Диплоидные клетки в отличие от перевиваемых имеют ограниченные возможности пассирования. Максимальное число пассажей 50±10, затем количество делящихся клеток резко уменьшается и они гибнут. Однако диплоидные клетки могут быть использованы в течение длительного времени, так как при каждом пассаже часть клеток можно заморозить (минус 196 °С) и при необходимости восстановить.

Диплоидные клетки имеют преимущества перед перевиваемыми и первичными клетками: 10–12 дней они могут быть в жизнеспособном состоянии без смены питательной среды; при смене среды один раз в неделю остаются жизнеспособны в течение 4 нед; особенно пригодны для длительного культивирования вирусов, у них сохранена чувствительность исходной ткани к вирусам.

Суспензионные культуры клеток. В 1953 г. Оуэне с сотр. показали способность клеток размножаться в свободно суспендированном состоянии. В последующие годы этот метод был значительно усовершенствован: была создана современная аппаратура, обеспечивающая размножение клеток со строго заданными параметрами (температура, рН, скорость перемешивания), а также адаптированы многие линии перевиваемых клеток к размножению в этих условиях (ВНК-21, Нер-2, МДВК и др.). Выращивание вирусов в суспензионных культурах клеток открывает большие возможности в промышленном производстве вакцин и диагностикумов. Однако только перевиваемые клетки хорошо культивируются в суспензии.

Новый подход к культивированию клеток в суспензии – применение микроносителей (сефадекс, силикагель, цитолар и др.). На микроносителях культивируемые клетки формируют монослой. Таким образом, этот способ позволяет методами суспензионного культивирования выращивать зависимые от прикрепления к твердому субстрату клетки: первичные, субкультуры, диплоидные. Эти клетки принято называть поверхностно зависимыми.

Способ культивирования на микроносителях (рис. 27) в настоящее время чрезвычайно популярен, так как он открывает большие перспективы в клеточной биотехнологии, в получении вакцин и других биологически активных веществ (интерферон, гормоны и т. д.).

Рисунок 27. Культивирование клеток на микроносителях (схема)

10.2 Хранение культур клеток. Каждый из трех основных типов клеточных культур – первичных культур, диплоидных штаммов и перевиваемых линий клеток, используемых в вирусологических исследованиях, часто приходится консервировать, так как при продолжительном пассировании клеток in vitro есть опасность бактериального загрязнения и неконтролируемых (генетических) изменений самих клеток.

Наиболее простой метод консервирования культур клеток – хранение их при 4 °С до 1–6 нед. Успешно применяют хранение клеточных штаммов в условиях сухого льда (минус 78 °С) и жидкого азота (минус 196 °С). Для этого клетки снимают с матрасов, суспендируют в концентрации 10 6 в 1 мл питательной среды, содержащей в качестве защитных веществ 10–40 % сыворотки и 10 % очищенного стерильного глицерина (вместо глицерина успешно применяют ДМСО – диметилсульфоксид). Затем клеточную суспензию разливают в ампулы, запаивают и выдерживают 1–3 ч при 4 °С, после чего замораживают клетки в смеси этилового спирта с сухим льдом. Скорость охлаждения не должна превышать 1 °С в 1 мин. При снижении температуры до минус 25 °С ампулы помещают для хранения в сухой лед. Если для хранения используют жидкий азот, то ампулы с клетками охлаждают до минус 70 °С и кладут в жидкий азот. Хранение клеток в жидком азот е в течение ряда лет не изменяет их пролиферативную активность и чувствительность к вирусам.

Восстанавливают замороженные клетки следующим образом: ампулу с замороженными клетками быстро погружают в водяную баню на 1–2 мин при легком встряхивании, затем клетки выливают в матрас, добавляют соответствующее количество ростовой среды и культивируют в термостате при 37 °С. Для удаления глицерина или ДМСО питательную среду заменяют на следующий день после посева.

При транспортировке клеток матрасы с выросшим монослоем заливают средой доверху и закрывают резиновой пробкой. В лаборатории питательную среду сливают и используют при культивировании этих клеток в виде добавок к питательной среде, применяемой в данной лаборатории.

Можно транспортировать и клеточную суспензию при 4 °С. При благоприятных условиях транспортировки, исключающих перегревание и замораживание клеток, 80–90 % из них сохраняют жизнеспособность до 7–8 дней.

Работа с культурой клеток требует абсолютной стерильности, тщательной подготовки посуды, соответствующих растворов, питательных сред и высокого качества воды.

10.3 Контаминация культур клеток. Работа с культурами клеток, их использование в вирусологических и других исследованиях, в биотехнологии требуют постоянного контроля на отсутствие посторонних агентов (контаминантов). Контаминантами могут быть вирусы, бактерии, грибы, микоплазмы и клетки других клеточных культур. Микоплазмы – одни из наиболее частых контаминантов, особенно в перевиваемых линиях клеток. Своевременное выявление их, других микроорганизмов или вирусов в культуре клеток – важное условие поддержания высокого качества последней. Паспортизация стабильных клеточных линий предусматривает в качестве необходимого теста контроль на отсутствие микоплазмоконтаминации, что должно стать обязательным для всех лабораторий, где работают с культурами клеток.

Резкое закисление питательной среды в культуральных флаконах и опалесценция ее могут быть следствием контаминации культур клеток микоплазмами. Для выявления последних используют следующие методы: посев на питательные среды, тест-культуры, цитологические, радиоавтографические и электронно-микроскопические.

В случае контаминации клеточные культуры уничтожают, а культивирование возобновляют из резервных расплодок, хранящихся в жидком азоте. Только редкие и уникальные культуры подлежат деконтаминации.

Предупредить размножение и подавить случайно попавшие в клеточную культуру бактерии удается с помощью противомикробных препаратов (антибиотиков и др.), добавляемых в ростовые среды непосредственно перед их использованием. Эти препараты следует строго дозировать и применять дифференцированно. Их использование – необходимое условие при возрастании риска контаминации в процессе получения первичных культур клеток при крупномасштабном суспензионном выращивании клеток, массовом производственном культивировании перевиваемых клеток, а также во всех случаях объединения клеточного материала.

При работе с культурами клеток используют многие антимикробные (нетоксичные) препараты в оптимальных дозах, характер действия которых приведен в таблице 5. Выбор эффективного препарата или комплекса препаратов зависит от чувствительности к ним конкретных контаминантов.

Таблица 5.

Противомикробные препараты для культур клеток (Л. П. Дьяконов и др.)