Поли-иэф сыворотка для иммуноэлектрофореза против сывороточных белков крови человека сухая. Встречный иммуноэлектрофорез Аппараты для иммуноэлектрофореза

Рис. 8. Принцип иммуноэлектрофореза.

Стадия 1: электрофорез антигена в агаровом геле. Антиген мигрирует на некоторое гипотетическое расстояние.

Стадия 2: ток выключен. В агаре вырезана канавка и заполнена антителами. Образуется дуга преципитации. Теоретически антиген диффундирует из точечного источника радиально, а антитела из канавки - ровным фронтом. Преципитаты, образующиеся в точках оптимальных соотношении антигена и антител, формируют дугу. Дуга расположена ближе всего к канавке там, где наиболее высока концентрация антигена.

Иммуноэлектрофорез помогает идентифицировать антигены по электрофоретической подвижности, особенно в том случае, когда в образце присутствуют и другие антигены.

С помощью данного метода в клинической иммунологии полуколичественно определяют концентрацию иммуноглобулинов и идентифицируют миеломные белки (рис.9).

Рис. 9. Основные классы иммуноглобулинов человека в сыворотке крови, выявляемые методом иммуноэлектрофореза. В канавку добавлена антисыворотка кролика. Показано расположение основных глобулиновых фракций. Выявлены три из пяти основных классов иммуноглобулинов человека: IgG, IgА и IgМ. Дуга преципитации IgG, распространяется от γ-области до ά 2 -глобулиновой области, что отражает чрезвычайную гетерогенность популяции антител как по аминокислотному составу, так и по суммарному заряду.

На основе сочетания электрофореза с иммунопреципитацией разработано несколько удачных методов, в каждом из которых перемещение антигена в электрическом поле приводит к его контакту с антителами. Встречный иммуноэлектрофорез может применяться для определения антигенов, миг­рирующих в агаре к положительно заряженному электроду.

Рис.10. Встречный иммуноэлектрофорез. Из-за эндосмоса антитела движутся в геле «назад»; антиген, отрицательно заряженный при данном рН, перемещается к положительному электроду и при контакте с антителами образует преципитат.

Данный метод занимает меньше времени и более чувствителен, чем двойная диффузия по Ухтерлони. Его применяют для идентификации антигенов вируса гепатита В и соответствующих антител, антител к ДНК при системной красной волчанке, аутоантител к растворимым ядерным антигенам при коллагенозах, а также антител (преципитинов) к Asperqillus при аллергическом бронхолегочном аспергиллезе.

Ракетный электрофорез - это количественный метод, предусматриваю-щий внесение антигена в гель, содержащий антитела. Линия преципитации имеет форму ракеты, длина которой определяется концентрацией антигена.

Рис.11. Ракетный электрофорез. Антиген, в данном случае сывороточный альбумин человека, подвергается электрофорезу в геле, содержащем антитела. Расстояние между стартовой лункой и передним краем дуги, имеющей форму ракеты, зависит от концентрации антигена. В данном случае относительные концентрации сывороточного альбумина человека составляют (слева направо) 3, 2 и 1.

Как и встречный электрофорез, это- быстрый метод, но и здесь антиген должен перемещаться к положительно заряженному электроду. Таким образом, ракетный электрофорез подходит для белков, например альбумина, трансферрина и церулоплазмина, в то время как концентрацию иммуногло-булинов обычно определяют методом простой радиальной иммунодиффузии.

Один из наиболее удачных вариантов ракетного электрофореза - двумерный или перекрестный иммуноэлектрофорез Лорелла. При этом на первом этапе смесь антигенов электрофоретически разделяют в геле агарозы. Затем разделенные белки вновь заставляют диффундировать в геле под влиянием электрического поля в другом направлении, перпендикулярном первому. Таким образом удается количественно определить каждый из антигенов смеси. Наиболее впечатляющий пример-это оценка степени конверсии СЗ в инактивированную форму СЗс, которая часто происходит при обострении в сыворотке больных системной красной волчанкой или синовиальной жидкости пораженных суставов в острой фазе ревматоидного артрита, а также в других случаях.

Рис.12. Перекрестный иммуноэлектрофорз.

а. Антигены разделяются по электрофоретической подвижности в агаровом геле. Узкую продольную полоску (ограничена прерывистой линией), содержащую разделенные антигены, вырезают из геля и прикладывают к другому гелю, содержащему антисыворотку. Затем проводят электрофорез в направлении, перпендикулярном первому; при этом антигены реагируют с антисывороткой, содержащейся в геле, с образованием пиков преципитации. Площадь под пиком зависит от концентрации данного антигена.

б. Электрофореграмма, показывающая превращение компонента комплемента СЗ (С3 → С3с) в сыворотке. Гель дополнительно окрашен. В данном случае дуги сливаются между собой, поскольку антигены имеют общие детерминанты.

в. «Горная фантазия», - эта электрофореграмма, демонстрирует удивительные возможности перекрёстного иммуноэлектрофореза для разделения сложной смеси антигенов.

Иммунофлюоресценция заключается в том, что к молекуле антител присоединяется какой-либо флюоресцирующий краситель, например изотиоцианат натрия. Антигенный материал (бактерии, клетки или их компоненты), присоединившие меченые антитела, становятся видимыми в ультрафиолетовом свете. Метод не количественный, но весьма важный в иммуноморфологии для определения локализации антигенных структур или антител.

Конкуренция с радиоактивным антигеном (радиоиммунологический метод) - один из самых современных методов. Учет реакции антиген - анитело может осуществляться с помощью радиоизотопных методов в случае использования «меченых» антител или антигенов. Измерение радиоактивности преципитата дает возможность оценить количество антител или антигена в исследуемых образцах. Это увеличивает объективность оценки, убыстряет учет и повышает чувствительность реакции. Наиболее чувствии-тельны (определение 1 - 10 нг вещества) методы конкуренции за антитела немеченого антигена с меченым. Принцип метода заключается в следующем. Используют стандартное количество антисыворотки против исследуемого антигена и стандартное количество этого антигена, меченного радиоактив-ными 125 I, 131 I, 2 Н или другим изотопом. Соотношение их таково, что 70-80% меченого антигена связываются антителами, образовывая радиоактивный преципитат с величиной радиоактивности N. Если в реагирующую систему внести исследуемый на присутствие данного антигена субстрат, то при наличии антигена он конкурирует с меченым антигеном и радиоактив-ность преципитата снижается. Чем больше антигена в исследуемом образце, тем меньше радиоактивность преципитата. С помощью этого метода определяют концентрацию в крови, моче и других субстанциях таких веществ, которые из-за ничтожных концентраций не выявляются биохимическими методами (гормоны: инсулин, гормон роста, АКТГ, го-надотропин, дигоксин, соматотропин и др.).

Рис. 13. Метод выделения мембранного иммуноглобулина (IgМ - 8S) с поверхности В-лимфоцитов.

1. Мечение поверхностных белков лимфоцитов 125 I в присутствии лактопероксидазы (ЛП).

2. Лизис клеток и выход поверхностных белков в раствор.

3. Осаждение меченых иммуноглобулинов с помощью специфической анти-Ig-сыворотки.

4. Отмывание и осаждение преципитата.

5. Разрушение преципитата и электрофоретический анализ легких и тяжелых цепей в полиакриламидном геле

Иммуноферментный метод представляет собой разработку самых последних лет. По чувствительности он не уступает предыдущему, но более прост при наличии коммерческих реагентов. На стенки полистереновых пробирок сорбированы антитела против определенного антигена. В эту пробирку вносят исследуемый субстрат. При наличии данного антигена он соединяется с антителами. Субстрат сливают и в пробирку вносят антитела против этого же антигена. Эти антитела мечены ферментом, чаще всего пероксидазой хрома. Меченые антитела присоединяются к предыдущему комплексу и также остаются на стенках пробирки. Содержимое пробирки заменяют на смесь хромогена (ортофенилендиамин) с субстратом для данного энзима - Н 2 0 2 . Если в исследуемой жидкости был искомый антиген, энзим фиксируется на стенках пробирки, разложит Н 2 0 2: выделившийся кислород окрасит хромоген в желтый цвет.

Метод Уанье предполагает использование для учета преципитации фотоэлектронефелометра, с помощью которого регистрируется изменение оптической плотности сыворотки после добавления антигена. При разбавлении сыворотки дистиллированной водой оптическая плотность снижается. Если в сыворотке имеются антитела, а в качестве разбавителя используют водный раствор антигена, то кривая изменения оптической плотности будет иная. Вначале происходит снижение оптической плотности, при накоплении достаточного количества антигена снижение прекращается, затем наблюдает-ся повышение оптической плотности смеси антиген - антитело.

Феномен лизиса - способность некоторых антител растворять клетки, против которых они возникли. Эти антитела применительно к бактериям называются бактериолизинами, к эритроцитам - эритролизинами, или гемолизинами. Реакции иммунного лизиса характеризуются тем, что они не происходят при наличии только двух ингредиентов - антигена и антитела. Необходимо присутствие третьего компонента, получившего название комп­лемента. В разных количествах комплемент содержится в сыворотке крови многих животных; особенно много его в сыворотке крови морских свинок. Вначале реакция идет по типу агтлютинации, затем к комплексу антиген-антитело присоединяется комплемент и происходит локальное растворение оболочки бактерий, эритроцитов или других клеток.

Феномен цитотоксичности определяется антителами, называемыми цитотоксинами. Их действие заключается в том, что они проявляют токсический эффект, лишая клетки жизнеспособности. Реакцию по выявлению цитотоксинов ставят со взвесью клеток в изотоническом буферном растворе хлорида натрия. К ним добавляют краситель, например, эозин или трипановый синий. Живые клетки не красятся, погибшие клетки быстро воспринимают краску (в течение 30 с). Если к взвеси клеток доба-вить иммунную сыворотку, содержащую цитотоксины и комплемент, то клетки будут гибнуть и при пробе с красителями окрасятся. Процент погибших клеток свидетельствует о количестве цитотоксинов в сыворотке крови. Реакция требует обязательного присутствия комплемента.

Реакция связывания комплемента (РСК) основана на описанном выше свойстве комплемента присоединяться к комплексу антиген - антитело. Говоря более точно, комплемент фиксируется на специальном участке тяжелой цепи молекулы антитела. Однако этот участок становится доступным только после присоединения антитела к антигену. Соединившись с одним комплексом антиген - антитело, комплемент не может перейти на другой комплекс, вводимый в реагирующую систему после взаимодействия первого комплекса и добавленного в известном количестве комплемента. В качестве второго комплекса обычно используют так называемую гемоли-тическую систему - смесь эритроцитов барана с антителами против них. Если первый комплекс является комплексом антиген - антитело, то свободного комплемента в реагарующей смеси не будет; гемолиза эритро­цитов не произойдет. Наоборот, если в исследуемом материале (например, в сыворотке крови) нет антител к использованным антигенам, то комплемент останется свободным и обеспечит гемолиз эритроцитов. РСК применяют при диагностике сифилиса (реакция Вассермана), изучений противотканевых антител и аутоантител; она широко используется при диагностике ряда вирусных инфекций.

Феномен специфической задержки часто используют для сравнения двух изучаемых антигенов. Например, готовят иммунную сыворотку против эритроцитов мыши. Чтобы определить, содержатся ли в ней антитела против эритроцитов родственного вида животных (крысы), сыворотку обрабатывают эритроцитами крысы. Если уровень антител в сыворотке снижается, то имеются родственные антигены, если совсем падает, то антигены идентичны. С помощью этой реакции проанализированы на тождественность или нетождественность многие родственные антигены и гаптены.

Реакция нейтрализации токсинов . Антитоксинами называют антитела против бактерийных и некоторых других (например, змеиный яд) токсинов антигенной природы. Антитоксины, соединяясь с соответствующими токсическими веществами, нейтрализуют их. Степень нейтрализации может быть учтена посредством введения восприимчивому животному смеси токсин- антитоксин. Количество антитоксина в иммунной сыворотке ха­рактеризуют тем количеством минимальных смертельных доз токсина, которое может быть нейтрализовано определенным количеством сыворотки. Реакцией нейтрализации пользуются для определения концентрации токсинов возбудителей дифтерии, столбняка и др. Для этого применяют стандартизированные антитоксические сыворотки.

Феномен опсонизации заключается в том, что антитела усиливают фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов в отношении тех антигенных субстанций или микроорганизмов, против которых они получены. Например, активность фагоцитов в отношении стафилококков значительно усиливается, если обработать лейкоциты или донора лейкоцитов антистафилококковой сывороткой. Такое действие связывали с наличием особых антител опсонинов. Следует, однако, иметь в виду, что специальных антител опсонинов, гемолизинов, бактериолизинов или преципитинов нет. Это лишь проявления основной функции молекул иммуноглобулинов дать специфический комплекс антиген - антитело.

Д. Грей приводит хороший пример единства и многообразия этой функции. Антитела, приготовленные против пневмококкового полисахарида I типа, могут:

1) вызывать агглютинацию пневмококков I типа и набухание их капсулы;

2) вызывать преципитацию растворимого экстракта из пневмококков I типа;

3) присоединять комплемент, т. е. обеспечивать РСК;

4) оказывать опсонизирующее действие на лейкоциты в отношении пневмококков I типа;

5) осуществлять специфическую защиту животных против пневмококковой инфекции.

Несмотря на это, в различных конкретных экспериментальных или клинических ситуациях предпочтение отдают конкретным реакциям антиген - антитело. При диагностике брюшного тифа используют реакцию Видаля - агглютинацию бактерий, для анализа антигенных компонентов сложных биологических жидкостей или тканевых экстрактов - реакции преципитации в агаре в виде иммунодиффузии или иммуноэлектрофореза. При работе с токсинами и многими растворимыми антигенами пользуются методами пассивной гемагглютинации. Для определения уровня гормонов в крови наиболее приемлем радиоиммунологический метод и т. д. Различные классы иммуноглобулинов различно проявляют функцию соединения с антигеном.

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Вводится взамен метода, изложенного в ФС 42-3874-99

Настоящая общая фармакопейная статья предназначена для исследования антигенного состава биологических материалов, а также для определения чистоты, качественного и количественного состава иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП) методом иммуноэлектрофореза (ИЭФ) в агаровом геле, сочетающим методы зонального электрофореза и иммунодиффузию.

В процессе иммуноэлектрофореза в гелях или на пленках из ацетата целлюлозы с помощью методов простой или двойной иммунодиффузии происходит реакция между растворимыми белками и специфическими по отношению к ним преципитирующими антителами. Количественное определение белков можно осуществлять с помощью электрофореза в среде, содержащей антитела (электроиммуноанализ, электроиммунодиффузия, ракетный иммуноэлектрофорез). Антигенную природу белковых компонентов можно исследовать путем их сравнения с известными маркерами.

Эффективность иммунохимических тестов зависит от специфичности используемых антисывороток, а также от их титра и сродства к антигенам.

Обычно иммуноэлектрофорез представляет собой сочетание электрофореза в агаровом (или агарозном) геле с последующей двойной иммунодиффузией в той же среде. При двухмерной двойной иммунодиффузии антиген и антитела, помещенные в круглые или прямоугольные углубления в геле, мигрируют навстречу друг другу, в результате чего при встрече образуются линии (дуги) преципитации. Положение полос преципитации зависит от коэффициента диффузии антигена, его концентрации относительно антител (скорость диффузии антитела можно рассматривать как постоянную). Определенное соотношение концентраций антигена и антител, которое является оптимальным для образования преципитата называется зоной эквивалентности. При этом получаются четкие линии преципитации.

Концентрация (титр) антител в иммунной сыворотке также может значительно варьировать. Возможна ситуация, при которой зоны эквивалентности для разных компонентов смеси не будут перекрываться. Для подбора эквивалентного соотношения антиген-антитело иммуноэлектрофорез многокомпонентных смесей рекомендуется проводить при нескольких относительных концентрациях антиген-антитело, так как при использовании только одной такой концентрации можно не обнаружить те или иные компоненты.

Метод иммуноэлектрофореза в агаровом геле

Обработанную спиртом стеклянную пластину размером 90х120 мм помешают строго горизонтально на предметный столик. Охлажденный до температуры (45±5) 0 С агаровый гель наносят на стеклянную пластину в количестве 18,0-20,0 мл. После застывания при комнатной температуре через 20-30 мин на пластине образуется агаровый слой толщиной 2,0 – 2,5 мм.

После застывания геля в нем по специальному трафарету вырезают 6-7 лунок диаметром 1-2 мм. Лунки заполняют испытуемым образцом в объеме, не превышающем объем лунки (по 2 лунки на каждый испытуемый образец). При этом в верхнюю и нижнюю лунки стеклянной пластинки с гелем вносят контрольный образец — нормальную сыворотку крови человека («Стандартный образец тест-системы для определения фракционного (антигенного) состава препаратов из сыворотки крови человека методом иммуноэлектрофореза» или иной контрольный образец в соответствии с указаниями в фармакопейной статье или нормативной документации), окрашенный пиронином Б (или иным красителем, указанным в фармакопейной статье или в нормативной документации).

В мерный цилиндр вместимостью 1000 мл вносят 500 мл веронал-мединалового или боратного буферного раствора, доводят объем раствора до метки водой очищенной и перемешивают. Полученный раствор (или иной буферный раствор указанный в фармакопейной статье или нормативной документации) наливают в электродные секции камеры прибора для электрофореза.

Пластину с подготовленным гелем помещают в прибор для электрофореза и соединяют с буферным раствором в электродных камерах прибора с помощью нескольких слоев фильтровальной бумаги. В случае конструкции прибора для электрофореза, предусматривающей соединение агара на пластине с электродным буфером с помощью агаровых столбиков, пластину устанавливают в уравновешенный прибор и заливают расплавленным агаром до его соединения с агаровыми столбиками и образования слоя геля толщиной 1 – 2 мм.

Прибор для электрофореза накрывают крышкой и включают источник питания (напряжение 70-200 В, сила тока 10-40 мА). Электрофорез проводят в течение 1,5-3 ч до момента, когда пятно пиронина Б, соответствующее миграции альбумина, будет находиться на расстоянии 20-25 мм от лунки.

После проведения электрофореза с помощью специального трафарета между лунками в агаровом геле вырезают продольные «канавки» (параллельные направлению миграции). В «канавки» вносят по 0,25 мл преципитирующуей антисыворотки: против сывороточных белков крови человека (при проведении испытаний фракционного состава) или поливалентную сыворотку против сывороточных белков крови человека, крупного рогатого скота, лошади и свиньи (для подтверждения подлинности).

Пластину с агаровым гелем помещают во влажную камеру и выдерживают при температуре (5±3) 0 С в течение 24 — 48 ч.

Для отмывания белков, не вступивших в реакцию преципитации, пластину с агаром помещают в кюветы, заливают 0,9% раствором натрия хлорида и выдерживают в течение 16-18 ч. Раствор меняют 3-4 раза. Затем пластину извлекают из 0,9% раствора натрия хлорида, накрывают фильтровальной бумагой, смоченной в 0,9% растворе натрия хлорида и высушивают на воздухе до превращения агарового геля в тонкую пленку. После этого пластину с высушенным гелем накрывают фильтровальной бумагой, смоченной в 0,9% растворе натрия хлорида, не оставляя пузырьков воздуха, и высушивают при комнатной температуре или в сушильном шкафу при температуре не выше 40°С. После высушивания пластинки фильтровальную бумагу смачивают водой и аккуратно удаляют.

Для окрашивания белков используют краситель амидочерный 10Б или другой пригодный краситель (в соответствии с указаниями в фармакопейной статье или нормативной документации), помещая пластину в кювету с красящим раствором на 30-40 мин. Затем пластину промывают в растворе для отмывки агара (2% раствор уксусной кислоты или иной раствор, в соответствии с указаниями в нормативной документации) в течение 15-40 мин до полного отсутствия окрашенного фона и снова высушивают при комнатной температуре или в сушильном шкафу при температуре не выше 40°С.

Липопротеиды окрашивают суданом черным В. Для окрашивания полностью высушенные пластины помещают на 3 ч в красящий раствор, затем обесцвечивают 50% этанолом до полного просветления фона. Липопротеиды окрашиваются в темно-синий цвет. Следует проводить окрашивание полностью высушенного препарата, так как судан черный В нерастворим в воде и окрашивает влажный гель.

Учет результатов при исследовании фракционного состава препаратов иммуноглобулинов человека проводят визуально путем сравнения электрофореграммы испытуемого образца с электрофореграммой контрольного образца – нормальной сыворотки крови человека («Стандартный образец тест-системы для определения фракционного (антигенного) состава препаратов из сыворотки крови человека методом иммуноэлектрофореза» или иной контрольный образец в соответствии с указаниями в нормативной документации), которая должна проявлять регламентированное количество линий преципитации с сывороткой против сывороточных белков крови человека (не менее 15 линий преципитации при использовании «Стандартного образца тест-системы для определения фракционного (антигенного) состава препаратов из сыворотки крови человека методом иммуноэлектрофореза»). Основной компонент препарата иммуноглобулинов человека должен соответствовать иммуноглобулину G (Ig G) нормальной сыворотки крови человека.

Учет результатов при проведении исследований по подтверждению подлинности препаратов крови человека проводят визуально путем выявления линий преципитации с сывороткой против сывороточных белков крови человека, крупного рогатого скота, лошади и свиньи. Должны выявляться линии преципитации только с сывороткой против сывороточных белков крови человека.

Примечания

1. Приготовление 0,05М веронал-мединалового буферного раствора (рН 8,6±0,1). В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 1,38 г веронала, 8,76 г мединала, добавляют воды очищенной до метки и перемешивают до полного растворения.

1. Приготовление 0,05М боратного буферного раствора (рН 8,6±0,1). В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 6,7 г борной кислоты, 13,4 г натрия тетраборнокислого 10-водного, добавляют воды очищенной до метки и перемешивают.
2. Приготовление 1,25% агарового геля . Приготовление агарового геля осуществляют одним из следующих способов:
3. Для приготовления 1,25% агарового геля используют 0,05М веронал-мединаловый буфер (рН 8,6±0,1) с удвоенной концентрацией солей (соответственно, 2,76 г веронала и 17,52 г мединала на 1000 мл воды очищенной).
4. Для приготовления 1,25% агарового геля используют боратный буферный раствор (рН 8,6±0,1) с удвоенной концентрацией солей (соответственно: 13,4 г борной кислоты и 26,8 г натрия тетраборнокислого 10-водного на 1000 мл воды очищенной).

В химический стакан вместимостью 1000 мл вносят 12,5 г агара, добавляют 500 мл воды очищенной и оставляют для набухания геля в течение часа при температуре (20±1) 0 C. Стакан с содержимым помещают в кипящую водяную баню и выдерживают до полного расплавления агара. Объем раствора геля доводят водой до 500 мл, затем добавляют равный объем веронал-мединалового или боратного буферного раствора (или иного буферного раствора, указанного в фармакопейной статье или в нормативной документации). Раствор агара фильтруют через 2-3 слоя марли, прибавляют тиомерсал до концентрации 100 мкг/мл и разливают во флаконы по 40-50 мл (количество, необходимое на две пластинки). Расплавленный агар должен быть прозрачным.

1. Приготовление красящего раствора амидочерного 10Б. Приготовление раствора красителя осуществляют одним из следующих способов:
2. В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 1,0 г амидочерного 10Б, 450 мл 0,1М раствора уксусной кислоты, 550 мл 0,1М раствора натрия ацетата и перемешивают.
3. В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 1,0 г амидочерного 10Б, 100 мл уксусной кислоты ледяной, доводят объем до метки водой очищенной и перемешивают. Через 12 ч фильтруют через бумажный фильтр.
4. Приготовление красящего раствора судан черный В. В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 1,2 г судана черного В, 20 мл 1М раствора натрия гидроксида, 380 мл воды очищенной и доводят объем раствора этанолом абсолютным до метки и перемешивают. Смесь непродолжительное время кипятят, охлаждают до комнатной температуры и после остывания краситель переливают в темную склянку с притертой пробкой. Реактив хранят при комнатной температуре в течение 3 мес.
5. Приготовление 2% раствора уксусной кислоты для отмывки агара . В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 20,0 мл уксусной кислоты ледяной, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Реактив хранят при комнатной температуре в течение 3 мес.

Принцип встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ) заключается в одновременном движении в геле навстречу друг другу антигенов и антител под действием электрического тока.

В результате их специфического взаимодействия образуется линия преципитата. Метод сочетает простоту реакции диффузной преципитации в геле с высокой разрешающей способностью электрофореза. Хотя по чувствительности этот метод уступает методу флюоресцирующих антител и реакции непрямой гемагглютинации, однако для него не требуется люминесцирующих антител, люминесцентного микроскопа и эритроцитарного диагностикума.

ВИЭФ - качественный метод. Он отличается высокой специфичностью, прост в выполнении. Его можно применять для обнаружения бактериальных или вирусных антигенов в патологическом материале, органах лабораторных (биопробных) животных или объектах окружающей среды.

Материалы и оборудование . 1. Агароза А и В. 2. 0,05 М мединал- HCl буфер (pH 8,6). 3. Хлорид натрия. 4. Фосфат натрия двузамещенный. 5. Фосфат калия однозамещенный. 6. Хлорид калия. 7. Оксалат аммония. 8. Специфический бактериальный или вирусный антиген. 9. Камера для электрофореза. 10. Выпрямитель постоянного тока на 50 мА. 11. Термостат электрический суховоздушный. 12. Центрифуга лабораторная настольная.

Техника постановки . На стеклянную пластинку, установленную горизонтально, наливают 30 мл расплавленной 1%-й агарозы, приготовленной на мединал - HCl буфере (pH 8,6). После того как гель застынет, в нем пробойником вырезают два двойных ряда лунок диаметром 5 мм (по 8 лунок в каждом ряду); расстояние между двойными рядами составляет 30 мм. Из лунок удаляют гель, собирают в пробирку, растапливают над пламенем горелки и с помощью пастеровской пипетки вносят на дно лунок.

Со стороны катода помещают исследуемый материал, а со стороны анода - моноспецифическую сыворотку, но лучше моноклональные антитела (МКА) в объеме 0,035 мл. Например, для обнаружения пневмококка - антапневмококковую сыворотку, для выявления антигена вируса гриппа - противогриппозную и т. д.

Пластинку помещают в камеру для электрофореза таким образом, чтобы поролон, применяемый в качестве соединительного мостика между буферной системой и гелем-носителем, касался последнего. Электрофорез проводят при комнатной температуре при напряжении 140…150 В и силе тока 35 мА в течение 18…35 мин.

Контроль . Исследование материала в ВИЭФ на присутствие специфического антигена должно сопровождаться контролем с заведомо положительным материалом.

Обнаружение возбудителя при сочетании ВИЭФ с подращиванием . Для посева загрязненного материала следует использовать селективные среды.

После 36-часовой инкубации при 37 °С в чашку вносят 0,3 мл 0,85%-го раствора NaCl с 4 % формалина, делают смыв, который отсасывают в пробирку и после экспозиции в течение 1 ч исследуют в ВИЭФ.

Учет результатов . При положительном результате появляется линия прещшитата между лункой с исследуемым материалом и лункой со специфической сывороткой. Линия преципитата в зависимости от количества антигена в исследуемом материале может располагаться либо посередине расстояния между лунками, либо ближе к резервуару с сывороткой.

Обычно линии преципитата формируются через 18…35 мин после начала электрофореза.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .

Описание

Сыворотка для ИЭФ содержит антитела против белков сыворотки крови человека. В иммуноэлектрофорезе с нормальной сывороткой крови человека препарат должен выявлять не менее 15 линий преципитации в соответствующих зонах: в a-зоне – альбумин, a 2 -макроглобулин; в β-зоне – трансферрин, церулоплазмин; в γ-зоне – линии IgG, IgА, IgМ и др.
Сыворотка должна полностью растворяться в течение 5 мин после добавления в ампулу (флакон) 1,0 мл воды очищенной. После растворения сыворотка должна быть прозрач¬ной, без осадка и посторонних включений, розова¬то-желтого цвета. Допустима небольшая опалесценция в проходящем свете.

Форма выпуска

Выпускается в ампулах по 1 мл (10 флаконов).

Состав

Сыворотка для иммуноэлектрофореза против сывороточных белков крови человека сухая представляет собой лиофилизат иммунной сыворотки крови овец, иммунизированной нормальной сывороткой крови человека.
Набор состоит из сыворотки для иммуноэлектрофореза против сывороточных белков крови человека.

Сыворотка для ИЭФ против сывороточных белков крови человека. Пористая масса от беловато-серого до розовато-желтого цвета 10 ампул (флаконов) по 1 мл

Показания для применения

Предназначена для качественного и количественного определения иммуноглобулинов и различных белков в сыворотке крови, других биологических жидкостях человека и препаратах крови методом иммуноэлектрофореза (ИЭФ).

Режим дозирования и способ применения

Анализируемые образцы следует хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение 7 сут или при температуре не выше минус 18 °С не более 1 года. Замороженные образцы перед исследованием следует разморозить и тщательно перемешать путем встряхивания. Повторное замораживание не допускается.

ОБОРУДОВАНИЕ, РЕАГЕНТЫ И МАТЕРИАЛЫ
Оборудование: прибор для иммуноэлектрофореза с выпрямителем электрического тока, весы аналитические, плитка электрическая, рН-метр, холодильник, предметный столик с регулируемым уровнем, пластины стеклянные (90 × 120) мм, влажная камера, мерная посуда, дозаторы пипеточные со сменными наконечниками, контейнер для обеззараживания.
Реагенты и материалы:
– агар;
– амидо черный 10Б;
– веронал;
– вода очищенная;
– глицерин;
– кислота борная;
– кислота уксусная;
– мединал;
– мертиолят (тимерозал);
– натрий тетраборнокислый 10-водный;
– натрия хлорид;
– пиронин Б;
– бумага фильтровальная лабораторная;
– перчатки одноразовые;
– дезинфицирующие растворы.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Иммуноэлектрофорез.
Метод ИЭФ основан на способности заряженных частиц перемещаться в агаровом геле под действием электрического поля и на специфической преципитации этих частиц соответствующими иммунными сыворотками с образованием видимых иммунных комплексов.
Вскрыть ампулы (флаконы) с сывороткой для ИЭФ и растворить содержимое каждой в 1,0 мл воды очищенной.
Приготовление буферных растворов.
Веронал-мединаловый буферный раствор 0,05 М рН 8,6±0,1 (веронал – 1,38 г, мединал – 8,76 г, вода очищенная до 1 л);
Боратный буферный раствор, 0,05 М, рН 8,6±0,1 (борная кислота – 6,7 г, натрий тетраборнокислый 10-водный – 13,4 г, вода очищенная – до 1 л).
Использовать любой из приведенных буферных растворов.
Перед заливкой буферного раствора в электродные камеры прибора для ИЭФ, его следует развести водой очищенной в 2 раза.
Приготовление натрия хлорида раствора 0,9 %.
9 г натрия хлорида перенести в мерную колбу на 1 л, налить воду очищенную до метки и перемешать до полного растворения.

Приготовление красящего раствора.
1 г амидо черного 10 Б перенести в мерную колбу вместимостью 1 л, налить небольшое количество воды очищенной, прилить 70 мл кислоты уксусной, довести объем водой очищенной до метки и перемешать.
Приготовление раствора для отмывки агара после окрашивания.
В мерную колбу вместимостью 1 л налить 25 мл кислоты уксусной, добавить 20 мл глицерина, довести объем водой очищенной до метки и перемешать.
Приготовление агарового геля 1 % на буферном растворе.
Количество агарового геля должно быть рассчитано заранее в зависимости от числа пластин. 1 г агара перенести в стакан, 2-3 раза промыть водой очищенной и варить на кипящей водяной бане в 50 мл воды очищенной до полного растворения. Сваренный агар перенести в мерный цилиндр объемом 100 мл и довести уровень содержимого до метки подогретым буферным раствором. Внести 0,1 г мертиолята и перемешать. Агаровый гель должен быть однороден, прозрачен и не должен содержать механических примесей.

Заливка стеклянных пластин агаровым гелем.
На уравновешенный с помощью уровня предметный столик установить стеклянные пластины (90±120) мм. Расплавленный и охлажденный до температуры (55±5) °С агар осторожно нанести на стеклянные пластины из расчета 20 мл расплавленного агара на пластину. После застывания агара пластины установить в приборе для ИЭФ. Агаровый гель на пластинах соединить с буферным раствором в электродных камерах прибора с помощью фильтровальной бумаги, сложенной в 5-6 слоев.
Соединение агара на пластинах с буферным раствором возможно и с помощью агаровых мостиков.

Проведение ИЭФ.
В слое агара пробить лунки, используя для этого специальный штамп, а после проведения электрофореза вырезать поперечные канавки.
После удаления из лунок агара заполнить их с помощью пипеточного дозатора растворенной контрольной сывороткой крови человека и анализируемыми образцами. В одну из лунок внести краситель пиронин Б (для контроля продвижения фракций).
Прибор для ИЭФ накрыть крышкой с платиновыми электродами и подсоединить к выпрямителю электрического тока. Электрофорез проводить при напряжении 70-150 В и силе тока 10-50 мА в течение 2-3 ч. Процесс электрофореза остановить, когда пятно пиронина, соответствующее миграции альбумина, будет находиться на расстоянии 20-25 мм от лунки.
После проведения электрофореза извлечь пластины из прибора. Внести в канавки растворенную сыворотку для ИЭФ. Пластины поместить во влажную камеру и выдержать в холодильнике при температуре (5±3) °С в течение 48 ч.

После инкубации в агаровом геле образуются линии преципитации.


Окрашивание агара.
Пластины можно фотографировать контактным методом или в проходящем свете или высушивать и окрашивать раствором амидо черного 10 Б. Для этого пластины поместить в кюветы, залить натрия хлорида раствором 0,9 % и выдержать в течение 16-18 ч для отмывания от непреципитировавших белков. Затем пластины с агаровым гелем накрыть фильтровальной бумагой, смоченной в натрия хлорида растворе 0,9 %, и высушить на воздухе до превращения агарового геля в тонкую пленку.
С высушенных пластин снять фильтровальную бумагу и поместить в кюветы с красящим раствором на 30-40 мин. Затем отмыть в растворе для отмывки агара после окрашивания в течение 5-10 мин и снова высушить.

Учет результатов.
Учет результатов проводить визуально.

Принцип действия и конструкция
Принцип действия прибора состоит в том, что антигены и антитела в электрическом поле обладают различной электрофоретической подвижностью.
Антигены, обладая электрофоретической подвижностью?-глобулинов, передвигаются в направлении положительного электрода - анода, в то время, как антитела, относясь к?-глобулинам, передвигаются в направлении отрицательного электрода - катода.
Взаимодействуя в эквивалентных соотношениях, антигены и антитела образуют в геле держателя неокрашенную, перпендикулярную к направлению тока в среде, линию преципитации, позволяющую судить о наличии или отсутствии антигена в исследуемой сыворотке.
Конструктивно прибор состоит из блока питания с выходным напряжением 30 В и 60 В, электрофоретической камеры на 26 проб, поддона, устройства заливки геля и нанесения лунок.

Порядок работы
Перед началом работы готовятся буферные растворы и агаровые гели в соответствии с рекомендациями, приведенными в описании прибора, закрепляется в горизонтальном положении держатель геля, после чего углубления держателя заполняются жидким гелем и выдерживаются до застывания геля.
Исследуемые сыворотки вносятся в гелевые лунки (до 25 проб одновременно плюс лунка с контрольной сывороткой стандартной тест-системы),
Определение антигенов проводится по методикам, приведенным в описании прибора, и в соответствии с выбранным режимом электрофореза.
Наличие или отсутствие линии преципитации, видимой при косом освещении, позволяет судить о наличии или отсутствии антигенов в исследуемой сыворотке.
В описании прибора приведены 4 методики определения антигенов и антител, а также идентификации антител в реакции истощения стандартного антигена.

ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Прибор обеспечивает одновременное обследование 26 проб, одна из которых - контрольная.
Время проведения реакции - не более 25 мин при определении антигена гепатита В
Габаритные размеры основных блоков, мм
блок питания 282 * 115 * 95
камера 87 * 69 * 223
поддон 264 * 120 * 37
Масса основных блоков, кг
Блок питания / камера / поддон 2,2 / 04 / 03
Номинальное напряжение и частота, В / Гц 220 / 50
Потребляемая мощность, В·А, не более 25
Средний срок службы прибора, лет 5

Вы можете обратиться за более детальной информацией к производителю "Прибор иммуноэлектрофореза ПИЭФ-01 - анализатор ИФА за 7200 руб.".