К здоровья 1978 иммунологические исследования лизис лейкоцитов. Чем отличается анализ на аллерген и лизис лейкоцитов? Какому результату верить больше? Общая характеристика работы

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ включает выявление в благополучных хозяйствах и дворах плановыми аллергическими исследованиями реагирующих на туберкулин животных. От положительно реагирующих на туберкулин животных исследуют кровь реакцией специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) с использованием в качестве диагностикума туберкулинов ППД для млекопитающих, ППД для птиц и КАМ. Способ позволяет провести дифференциацию специфических и неспецифических положительных реакций на туберкулиновую пробу и диагностировать туберкулез на ранней стадии заболевания. 4 з.п. ф-лы, 7 табл.

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к экспресс-способам дифференциальной диагностики туберкулеза, вызываемого микобактериями разных видов.

Известно, что в благополучных хозяйствах первичный диагноз на туберкулез устанавливают комплексным способом - эпизоотологическим, клиническим, аллергическим, патологоанатомическим и лабораторным (1.)

Перечисленные способы диагностики во многих случаях не позволяют в короткие сроки исследования поставить окончательный диагноз на туберкулез.

Для массовых прижизненных исследований на туберкулез используют аллергическую диагностическую пробу (2). Однако появление массовых неспецифических реакций на туберкулин у нетуберкулезных животных не позволяет поставить в благополучных хозяйствах диагноз на туберкулез по положительной туберкулиновой пробе (1; 2).

Для дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций ставят симультанную пробу (прототип) с двумя аллергенами - ППД для млекопитающих и аллергеном КАМ, изготовленным из нескольких штаммов атипичных микобактерий (2; 3; 4).

Симультанную аллергическую пробу применяют при первичной постановке диагноза на туберкулез крупного и мелкого рогатого скота и кур в благополучных хозяйствах и в случае, если реакции на туберкулин обусловлены атипичными микобактериями и кислотоустойчивыми сапрофитами (3).

Владельцы высокоудойных коров оспаривают правомерность контрольно-диагностического убоя животных, давших положительную реакцию на туберкулиновую пробу, и требуют прижизненных способов диагностики для переисследования высокопродуктивных животных на туберкулез. Использование предлагаемого нами «Способа ранней диагностики туберкулеза животных» вносит ясность в этот спорный вопрос, так как позволяет установить однозначно специфичность или неспецифичность реакции организма животного на внутрикожное введение туберкулина и окончательно поставить диагноз.

Более того, проведение симультанной пробы допускается через 30 и более дней после последней туберкулинизации животных, что не отвечает требованиям ранней (доклинической) диагностики туберкулеза в короткие сроки исследования.

Таким образом, недостатками известных способов постановки диагноза на туберкулез являются трудоемкость, продолжительные сроки исследования и невозможность определения вида микобактерий в первые дни после заражения.

Способ основан на немедленно появляющейся повышенной чувствительности лейкоцитов к повторному контакту с антигеном (аллергеном) вне организма. Целью изобретения является разработка нового способа. Поставленная задача достигается использованием реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ).

Способ осуществляется путем исследования крови РСЛЛ от положительно реагирующих на туберкулин животных, выявленных в благополучных хозяйствах и дворах плановыми аллергическими исследованиями, с использованием в качестве диагностикума туберкулинов (ППД для млекопитающих, ППД для птиц и КАМ).

Причем при диагностике туберкулеза у крупного рогатого скота РСЛЛ проводится с ППД-туберкулином для млекопитающих, ППД-туберкулином для птиц и КАМ - комплексным аллергеном из атипичных микобактерий.

Диагностику туберкулеза у свиней выполняют с ППД-туберкулином для млекопитающих и ППД-туберкулином для птиц.

При диагностике туберкулеза у собак и плотоядных РСЛЛ используют ППД-туберкулин для млекопитающих.

Диагностику туберкулеза у кроликов и пушных зверей РСЛЛ проводят с ППД-туберкулином для млекопитающих, ППД-туберкулином для птиц и КАМ.

Организация исследований на туберкулез РСЛЛ

В опытах на кроликах, собаках, свиньях и телятах для сенсибилизации организма животных использовали живые микобактерии вакцинного штамма БЦЖ-1 в прививочных дозах: одна (0,05 мг), две (0,1 мг), три (0,15 мг), пять (0,25 мг) и десять (0,50 мг).

Исследования проводили в экспериментальных условиях на лейкоцитах крови интактных вакцинированных БЦЖ животных и в производственных условиях - коровах, дважды давших положительную реакцию на внутрикожное введение ППД-туберкулина для млекопитающих, в СПК « Рассвет» Матвеево-Курганского района.

Основная цель исследований - использовать результаты РСЛЛ для дифференциальной диагностики и определения:

1) сенсибилизации лейкоцитов организма животных микобактериями вакцины БЦЖ;

2) инфицирования коров, давших дважды положительную туберкулиновую реакцию;

3) неспецифических реакций на туберкулин при его внутрикожном введении.

В опыт отобрали клинически здоровых интактных животных, которые служили фоновым контролем. Группы формировали животными, у которых при 3-кратном исследовании проб крови получены стабильные величины значений гематологических показателей (количество лейкоцитов,% лизиса и др.).

В каждую опытную группу брали не менее трех животных. От каждого животного брали кровь, которую делили на контрольную и опытные пробы. В контрольной пробе к крови добавляли 0,9% физиологический раствор натрия хлорида, а в опытных пробах крови - туберкулины - ППД для млекопитающих, ППД для птиц и КАМ.

Для исключения ошибок внимания техники подсчета форменных элементов и получения достоверных средних величин значений показателей реакции крови каждую пробу (контрольную и опытные) исследовали в трех повторах.

Порядок проведения исследования на туберкулез РСЛЛ

Исследование животных на туберкулез вначале проводят методом туберкулинизации в порядке и сроки, предусмотренные «Эпизоотическим контролем и постановкой диагноза на туберкулез у животных разных видов» (2).

В качестве диагностикумов берут ППД-туберкулин для млекопитающих, ППД-туберкулин для птиц и комплексный аллерген из атипичных микобактерий (КАМ).

В благополучных по туберкулезу гуртах, группах и отдельных животных основным методом исследования является внутрикожная туберкулиновая проба. В случае выявления животных, реагирующих на туберкулин, то положительно реагирующих изолируют, ставят на привязь и берут от них кровь для исследования в реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) со следующими диагностикумами:

У крупного рогатого скота антикоагулянтную кровь в РСЛЛ берут с

а) физиологическим раствором хлористого натрия (контрольная проба);

г) ППД-туберкулином для птиц.

При этом животных, давших положительные результаты исследования РСЛЛ с ППД-туберкулином для млекопитающих, считают туберкулезными

У свиней антикоагулянтную кровь в РСЛЛ берут с

а) физиологическим раствором поваренной соли;

б) ППД-туберкулином для млекопитающих;

в) ППД-туберкулином для птиц.

Свиней, у которых РСЛЛ с ППД-туберкулином для млекопитающих оказалась положительной, признают туберкулезными, а животных, у которых РСЛЛ положительна с ППД-туберкулином для птиц, считают инфицированными микобактериями птичьего вида;

У собак и др. мелких животных РСЛЛ берут с

а) физиологическим раствором;

б) ППД-туберкулином для млекопитающих;

У кроликов антикоагулянтную кровь в РСЛЛ берут с

а) физиологическим раствором натрия хлорида;

б) ППД-туберкулином для млекопитающих;

в) ППД-туберкулином для птиц;

При этом кролики, давшие положительную РСЛЛ с ППД-туберкулином для млекопитающих, считаются инфицированными бычьим видом возбудителя туберкулеза, а с ППД-туберкулином для птиц - зараженными птичьим видом возбудителя, с КАМ - сенсибилизированными атипичными нетуберкулезными микобактериями.

Целью изобретения является сокращение сроков обнаружения в организме животных возбудителя туберкулеза и определение вида микобактерий, вызвавшего сенсибилизацию.

Достижение поставленной цели основано на явлении немедленного приобретения после внедрения возбудителя иммунокомпетентными клетками повышенной чувствительности организма, выявляемой при повторном воздействии вне организма того же антигена на лейкоциты крови. Повышенная чувствительность после инфицирования представляет собой клеточный феномен, в котором клетками-эффекторами, вступающими во взаимодействие с туберкулином вне организма, являются сенсибилизированные лейкоциты крови, что отличается от повышенной чувствительности замедленного типа (ПЧЗТ) организма, которая развивается у животных через 2-3 недели после заражения их возбудителем туберкулеза.

Осуществления способа

Способ ранней диагностики туберкулеза животных осуществляется следующим образом. В лунку планшета, содержащую 0,05 мл 3,8%-ного раствора цитрата натрия (гепарина, трилона Б или любой другой антикоагулянт) вносят 0,1 мл исследуемой крови и рабочую дозу туберкулина в объеме 0,05 мл (опытные пробирки). Контрольные пробирки заполняют в том же объеме физиологическим раствором без туберкулина. Кровь в лунках планшета инкубируют в течение 2 часов при t=37°C, встряхивая через каждые 30 минут. Затем из контрольной и опытной лунок по 0,02 мл крови переносят в лунку с 0,4 мл жидкостью Тюрка (3-5% раствор уксусной кислоты, подкрашенный несколькими каплями раствора метиленового синего) для разрушения эритроцитов и окраски ядер лейкоцитов. Подсчитывают число лейкоцитов (в камере Горяева) во всех лунках и рассчитывают показатели реакции специфического лизиса лейкоцитов (в процентах) по формуле

где Л к и Л о - абсолютное количество лейкоцитов в контрольной и опытной пробе. РСЛЛ считают положительной при показателе 10% и выше.

Пример 1. Рабочая доза туберкулинов

Схема опытов по определению рабочей дозы туберкулинов (соотношения антикоагулянта, крови и туберкулина)

В схеме опытов по определению рабочей дозы туберкулинов показано, что объемные соотношения антикоагулянта и крови в пробах оставались одинаковыми, а дозы туберкулинов возрастали: 0,05; 0,1 и 0,15 мл

Как видно из табл.1 и 2, РСЛЛ во всех пробах не превышает 3% у крупного рогатого скота, свиней, 7,4% у собак и 2% у кроликов, поэтому экономнее в качестве рабочей дозы использовать дозу 0,05 мл туберкулина, т.к. РСЛЛ у нее оказалась ниже, чем при дозе 0,15. И величина ее была практически одинаковой для ППД млекопитающих, ППД птиц и КАМ.

Таким образом, рабочая доза туберкулинов определена величиной 0,05 мл для РСЛЛ.

Пример 2. Специфичность и активность РСЛЛ крови бычков, вакцинированных БЦЖ-1

В опытах на 4-6-месячных бычках изучали специфичность и активность РСЛЛ. Для этого животным вводили живые микобактерии вакцинного штамма БЦЖ-1 в прививочных дозах: 0,05 мг, 0,15 мг, 0,25 мг и 0,50 мг (одна, три, пять, десять доз), а затем исследовали кровь в РСЛЛ в день вакцинации и через каждые 24 часа в течение 10 суток (240 часов).

Количество лейкоцитов в пробах крови с ППД для млекопитающих колебалось от 8,2 до 9,1·10 9 /л. Отличительно, что в пробах крови от бычков, вакцинированных БЦЖ, при взаимодействии с ППД для млекопитающих отмечали снижение количества лейкоцитов через 48-120 часов после введения вакцины по сравнению с другими пробами, однако число их было в границах нормы.

В эти же часы после введения живых микобактерий в пробах крови с физиологическим раствором ППД для птиц и КАМ количество лейкоцитов практически было одинаковым и колебалось от 9,2 до 11,3·10 9 /л, т.е. обнаруживали лейкоцитоз, который был тем сильнее, чем больше была прививочная доза микобактерий вакцинного шт. БЦЖ-1.

Как видно из табл.3, в пробах крови с ППД для млекопитающих положительная РСЛЛ обнаруживалась уже через 24 часа после сенсибилизации КРС вакциной БЦЖ, в пробах крови с ППД для птиц и КАМ показатели РСЛЛ были отрицательными.

Полученные результаты исследований свидетельствуют о специфичности РСЛЛ. РСЛЛ может быть использована для выявления животных, сенсибилизированных микобактериями с антигенами, родственными туберкулину.

Активность РСЛЛ характеризуется тем, что с повышением дозы живых микобактерий вакцинного шт. БЦЖ-1 с 0,05 мг до 0,50 мг на животное возрастает показатель РСЛЛ.

Так, установлено, что при вакцинации одной прививочной дозой БЦЖ-1 наибольший показатель РСЛЛ с ППД для млекопитающих был через 48-72 ч после инъекции (27-23%)

При сенсибилизации крупного рогатого скота тремя прививочными дозами положительные показатели РСЛЛ также наблюдаются в это же время. Максимальный процент лизиса достигает 32,5% после введения вакцины БЦЖ.

При введении животным пяти прививочных доз лизис лейкоцитов был более продолжительным и имел тенденцию к увеличению показателя. Особенно четко эта тенденция наблюдалась при введении животным 10 прививочных доз вакцины БЦЖ, когда лизис лейкоцитов через 48 часов после инъекции вакцины достигал 48,3% и был более продолжительным, т.е. с увеличением количества прививочных доз процент сенсибилизированных лейкоцитов возрастал и это сказывалось на показателях РСЛЛ (табл.3).

Результаты показателей РСЛЛ в зависимости от количества прививочных доз вакцины БЦЖ-1 свидетельствуют о выраженной активности РСЛЛ.

Так, среднесуточный показатель РСЛЛ с ППД для млекопитающих за 120 часов при одной прививочной дозе микобактерии БЦЖ составил 18,8%, трех - 20,8%, пяти - 19,24% и десяти - 32,2%. При десяти прививочных дозах БЦЖ положительные показатели РСЛЛ с ППД для млекопитающих удлиняются до семи суток.

Выполненные исследования с инъекциями живых микобактерии вакцинного шт. БЦЖ позволили установить специфичность и активность РСЛЛ, что необходимо для дифференциальной диагностики специфических и неспецифических реакций на туберкулин.

Пример 3. Исследование по определению у свиней сенсибилизации, вызванной введением живых микобактерий вакцинного шт. БЦЖ-1

Опыты выполняли на поросятах-отъемышах трех групп, которым инъекцировали по одной, три и пять прививочных доз вакцины БЦЖ. Количество лейкоцитов у сенсибилизированных свиней одной дозой вакцины БЦЖ с ППД для млекопитающих колебалось от 7,2 до 8,8·10 9 /л, а с физиологическим раствором ППД для птиц колебания составляли от 8,7 до 14,3·10 9 /л. Наибольшее количество лейкоцитов было через 48 часов после вакцинации. Та же закономерность отмечалась при введении трех и пяти прививочных доз вакцины БЦЖ, где количество лейкоцитов с физиологическим раствором и ППД для птиц через 48 часов достигало 15,4 и 18,6·10 9 /л соответственно. В результате показатель РСЛЛ с ППД для млекопитающих у сенсибилизированных свиней через 24 часа при одной прививочной дозе составил 26,9%, трех - 28,9%, пяти - 38,1%. Наибольший показатель РСЛЛ был через 48-72 часов после сенсибилизации и составил 46,6-49,7%; 41,5-46,7%; 49,7-55,4% соответственно дозам (табл.4).

У вакцинированных поросят положительные показатели РСЛЛ обнаруживали через 24-120 часов после введения одной, трех и пяти прививочных доз вакцины БЦЖ.

РСЛЛ с ППД для птиц была отрицательной, что подтверждает специфичность РСЛЛ с ППД для млекопитающих.

Пример 4. Исследование по определению у собак сенсибилизации, вызванной введением живых микобактерий вакцинного шт. БЦЖ-1

В опытах на собаках после введения одной, трех, пяти прививочных доз вакцины БЦЖ установлено, что через 24-72 часа при взаимодействии крови с физиологическим раствором численность лейкоцитов составила 5,2-6,2 10 9 /л, а с ППД для млекопитающих 3,4-4,7 10 9 /л, т.е. отмечалась лейкопения.

Количество лейкоцитов с физиологическим раствором было увеличено по сравнению с нормой в два и более раз. В результате показатели РСЛЛ составили при одной дозе 14-25%, при трех 20,8-60,6%, при пяти 22-68%. Наибольший показатель РСЛЛ был через 48 часов после вакцинации. Положительные показатели РСЛЛ отмечали при одной дозе через 24-96 часов, при трех через 24-120 часов, при пяти через 24-240 часов, т.е. с увеличением дозы вакцины увеличивалась продолжительность сенсибилизации лейкоцитов и возрастала активность - показатели РСЛЛ (табл.5).

Пример 5. Исследование по определению у кроликов сенсибилизации, вызванной введением живых микобактерий вакцинного шт. БЦЖ-1

При вакцинации кроликов пятью прививочными дозами вакцины БЦЖ самое низкое содержание лейкоцитов в крови при взаимодействии с ППД для млекопитающих обнаруживали через 24 и 72 часа (4,6-4,7 10 9 /л), а при десяти дозах наименьшее количество лейкоцитов при взаимодействии с ППД для млекопитающих было через 24 часов (3,8 10 9 /л) и 48 часов (4, 7 10 9 /л). Особенностью является то, что при взаимодействии крови с ППД для млекопитающих через 72-264 часа и через 408 часов после вакцинации количество лейкоцитов было в несколько раз выше, чем в норме, и составляло 11-28,5 10 9 /л, т.е. вместо лейкопении отмечался лейкоцитоз. И в это же время количество лейкоцитов в пробах с физиологическим раствором (контрольные пробы) значительно превышало численность их в опытных пробах и составляло 25,0-38,7 10 9 /л. Установлено, что на фоне лейкоцитоза, вызванного введением больших доз вакцины БЦЖ, РСЛЛ у кроликов была положительной и составляла от 13,7 до 72% (табл.5).

Пример 6. Исследование проб крови РСЛЛ коров, давших дважды положительную реакцию на туберкулин

Диагностику туберкулеза реакций специфического лизиса лейкоцитов РСЛЛ в производственных условиях выполняли в СПК « Рассвет» Матвеево-Курганского района.

В октябре 2006 г. на ранее благополучной ферме положительно прореагировали на туберкулин семь коров из 198 исследованных. При повторной туберкулинизации через 45 дней они вновь дали положительную реакцию. При внутрикожном введении туберкулина образовывались тестоватой консистенции разлитые припухлости, кожная складка утолщалась на 5-10 мм.

Перед убоем коров взяли кровь для исследования в реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ). Результаты исследований по количеству лейкоцитов и показателям РСЛЛ у коров, с выраженной реакцией на туберкулин, представлены в табл.6.

Как видно из табл.6, из семи коров, реагировавших на внутрикожное введение туберкулина, только у четырех РСЛЛ была положительна (инвен. №6827; №071; №4018; №148) при взаимодействии проб крови с ППД-туберкулином для млекопитающих. Пробы крови с ППД-туберкулином для птиц и КАМ дали отрицательные показатели РСЛЛ.

Ветеринарная экспертиза контрольно-диагностического убоя положительно реагирующих на туберкулин коров показала, что из четырех животных с положительными показателями РСЛЛ только у двух обнаружены в лимфатических узлах изменения, характерные для туберкулеза: у одной туши в подчелюстных и заглоточных, а у второй средостенных и брыжеечных лимфатических узлах. В тушах двух коров с положительной реакцией на туберкулиновую пробу и положительными показателями РСЛЛ патологоанатомических изменений, характерных для туберкулеза, во внутренних органах и лимфатических узлах визуально не обнаружено. Это, вероятно, связано с недавним инфицированием животных возбудителем туберкулеза, и патологоанатомические изменения еще не успели сформироваться. Кроме этого, при послеубойной контрольно-диагностической экспертизе было установлено, что положительные реакции на внутрикожное введение туберкулина дали две глубокостельные (7-8,5 мес. беременности) коровы и одна с острым эндометритом при стрептококковой инфекции. Патологоанатомические изменения у положительно прореагировавших на туберкулин коров показаны в табл.7.

Контрольно-диагностическая экспертиза убитых коров, реагировавших положительно на туберкулин, показала, что в четырех случаях из семи положительная туберкулиновая проба совпадала с положительной РСЛЛ (В=4:7=0,57); в одном случае (В=1:7=0,14) из трех коров с беременностью 7-8 мес. положительная туберкулиновая проба совпала с глубокостельностью (8 мес.; В=1:3=0,33); в одном случае - со стрептококковой инфекцией (острый эндометрит; В=1:7=0,14).

РСЛЛ в двух случаях из четырех положительных показателей совпадала с обнаружением патологоанатомических изменений, характерных для туберкулеза (В=2:4=0,5), и в двух случаях из четырех (В=2:4=0,5) визуальных патологоанатомических данных не обнаружено, что не может быть основанием для исключения раннего инфицирования микобактериями, когда еще патологоанатомические изменения не сформировались.

Литература

1. Диагностика туберкулеза. // В.П.Урбан, М.А.Сафин, А.А..Сидорчук, М.В.Харитонов, Р.С.Сигбатулин, Ф.Г. Акберов. // Практикум по эпизоотологии и инфекционным болезням с ветеринарной санитарией. Учебник. Москва: «Колос», 2003, с.82-86.

2. Эпизоотологический контроль и постановка диагноза на туберкулез у животных разных видов. Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных. Сборник санитарных и ветеринарных правил. Изд. официальное. Госкомсанэпиднадзор России. Минсельхозпром России. Москва. 1996, с.164-167.

3. Наставление по проведению симультанной пробы с применением туберкулина и комплексного Аллергена из атипичных микобактерий (КАМ) при диагностике туберкулеза животных. Ветеринарное законодательство. Том 3. Москва: «Колос», 1981, с.220-224.

4. Шаров А.Н. Туберкулез «Ветеринарные препараты» Справочник (под ред. д.б.н. Д.Ф.Осидзе). Москва: «Колос», 1981, с.192-201.

1. Способ ранней диагностики туберкулеза животных, включающий выявление в благополучных хозяйствах и дворах плановыми аллергическими исследованиями реагирующих на туберкулин животных, отличающийся тем, что от положительно реагирующих на туберкулин животных исследуют кровь реакцией специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) с использованием в качестве диагностикума туберкулинов ППД для млекопитающих, ППД для птиц и КАМ.

2. Способ ранней диагностики туберкулеза по п.1, отличающийся тем, что при диагностике туберкулеза у крупного рогатого скота РСЛЛ проводят с ППД-туберкулином для млекопитающих, ППД-туберкулином для птиц и КАМ-комплексным аллергеном из атипичных микобактерий.

3. Способ ранней диагностики туберкулеза по п.1, отличающийся тем, что при диагностике туберкулеза у свиней РСЛЛ выполняют с ППД-туберкулином для млекопитающих и ППД-туберкулином для птиц.

// 2341288 // 2443428

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии

Изобретение относится к области биотехнологии

ТРЕБОВАНИЯ

К ПОСТАНОВКЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПО ОБОСНОВАНИЮ ПРЕДЕЛЬНО ДОПУСТИМЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ПРОМЫШЛЕННЫХ ХИМИЧЕСКИХ АЛЛЕРГЕНОВ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ И АТМОСФЕРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

МУ 1.1.578-96

1. Разработаны НИИ медицины труда РАМН (Дуева Л.Л, Алексеева О.Г.), НИИ экология человека и гигиены окружающей среды РАМН (Пинигин М.А., Тепикина Л.А), Институтом иммунологии Минздравмедпрома России (Черноусов А.Д.), Центральным кожно-венерологическим институтом Минздравмедпрома России (Умеров Ж.Г.), Санкт-Петербургским НИИ гигиены труда и профзаболеваний Минздравмедпрома России (Сидорин Г.И., Мартинсон Т.Г.), Белорусским научно-исследовательским санитарно-гигиеническим институтом (Шевляков В.В.), Харьковским НИИ гигиены труда и профзаболеваний (Василенко Н.М.), Центральной научно-исследовательской лабораторией Латвийской медицинской Академии (Иванова И.А.).

2. Утверждены и введены в действие Первым заместителем Председателя Госкомсанэпиднадзора России - заместителем Главного государственного санитарного врача Российской Федерации С. В. Семеновым 21 октября 1996 г.

3. Введены взамен методических рекомендаций "Постановка исследований по гигиеническому нормированию промышленных аллергенов в воздухе рабочей зоны" (1980) и в дополнение к "Временным методическим указаниям по обоснованию предельно допустимых концентраций загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест" (1989).

^ 1. Область применения

Методические указания предназначены для токсикологов, занимающихся обоснованием гигиенических нормативов вредных веществ в воздухе рабочей зоны и атмосферы. Методические указания посвящены установлению гигиенических нормативов промышленных химических аллергенов в воздухе рабочей зоны и атмосферы. Более чем десятилетняя практика обоснования гигиенических нормативов (ПДК и ОБУВ) промышленных аллергенов в воздушной среде подтвердила эффективность данного мероприятия по профилактике развития аллергических заболеваний у рабочих аллергоопасных производств и населения промышленных регионов. Настоящие методические указания разработаны с учетом накопленных за эти годы данных по теории и практике токсикологической аллергологии. При этом предусмотрен единый подход к обоснованию гигиенических нормативов промышленных химических аллергенов в воздухе рабочей зоны и атмосферы.

Оценка аллергоопасности при установлении гигиенических нормативов химических соединений и сложных продуктов на их основе обязательно проводится в следующих случаях:

При нормировании новых химических соединений, принадлежащих к химическим классам, неизученным в аллергологическом плане;

При нормировании химических соединений и сложных продуктов, принадлежащих к химическим классам, содержащим уже известные аллергены, или имеющих химические аналоги, обладающие сенсибилизирующим действием;

При наличии жалоб аллергического характера или клинических признаков аллергических поражений у людей, имеющих контакт с данным химическим соединением или продуктом.

^ 2. Схема постановки исследований

Исследования проводят в два этапа. Цель 1-го этапа - выявление аллергенных свойств изучаемого вещества, 2-го этапа - обоснование величины гигиенического норматива (см. схему).

На 1-м этапе исследований используют методы экспресс-сенсибилизации морских свинок и мышей.

^ Схема постановки исследований

I этап - выявление аллергенных свойств

II этап - обоснование величины санитарного стандарта

А. Нормирование по аналогии

^ Б. Нормирование по ускоренной и полной схеме

При изучении простых химических соединений рекомендуется применение метода сенсибилизации морских свинок внутрикожно в зону уха и/или воспроизведение гиперчувствительности замедленного типа (далее - ГЗТ) на мышах.

Сенсибилизация морских свинок, как наиболее чувствительного вида лабораторных животных к действию химических аллергенов, позволяет оценить аллергенную активность изучаемого вещества. С этой целью животных сенсибилизируют введением в зону уха двух доз вещества: 50 и 200 мкг/животное. Воспроизведение ГЗТ на мышах позволяет выявить аллергенные свойства не только растворимых, но также нерастворимых в воде твердых и пастообразных веществ, обладающих сильной или умеренной аллергенной активностью. Поскольку введение мышам слабых аллергенов не проявляется развитием четко выраженной ГЗТ, при отрицательном или сомнительном результате данного эксперимента на мышах следует дополнительно провести сенсибилизацию морских свинок в дозе 200 мкг/животное. При этом, а также для веществ с предполагаемой слабой аллергенной активностью не исключается использование еще более высокой сенсибилизирующей дозы - 500 мкг/животное. При изучении сложных по составу и неотвержденных полимерных продуктов осуществляют комбинированную сенсибилизацию морских свинок (в кожу уха и дополнительно эпикутанно) и/или применяют метод воспроизведения ГЗТ на мышах.

В дополнение к этим обязательным приемам исследований I-го этапа по соответствующим показаниям могут быть использованы также и другие способы сенсибилизации животных. Так, при исследовании химических соединений и продуктов, особенно пастообразных и вязких, загрязняющих кожные покровы рабочих, целесообразна проверка возможности развития контактной аллергии методом многократных эпикутанных аппликаций на морских свинках. Для водонерастворимых промышленных пылей уже на I-м этапе исследования может быть применен способ внутритрахеальной сенсибилизации белых крыс.

Если на I-м этапе исследования аллергенные свойства у изучаемого вещества не выявлены, то его нормируют как вещество общетоксического действия. Если хотя бы один из приемов сенсибилизации позволил выявить аллергенные свойства изучаемого вещества, то обязательно проводят II-й этап исследований.

II-й этап исследований, в зависимости от приема нормирования (по аналогии, ускоренной или полной схеме), включает следующие токсиколого-аллергологические эксперименты.

При нормировании по аналогии проводят сравнение выраженности и частоты сенсибилизации у животных, вызванных введением референс-аллергена и изучаемого вещества, используя методы экспресс-сенсибилизации I-го этапа. При нормировании нерастворимых пылей возможно также применение внутритрахеальной сенсибилизации белых крыс. Для простых химических соединений референс-аллергеном является уже нормированное вещество, сходное по своей химической структуре и содержащее одинаковые ответственные за развитие сенсибилизации активные химические группы. Референс-аллергеном для сложной композиции служит уже нормированная композиция, близкая по составу и содержащая одинаковый ответственный за развитие сенсибилизации ингредиент.

При отсутствии референс-аллергена II-й этап исследований включает экспериментальное определение порогов сенсибилизации: при однократной ингаляции вещества - Lim sens ас , при многократных ингаляциях - Lim sens ch . Сравнение величин Lim sens ас и Lim sens ch с Lim ас и Lim ch , установленных в токсикологических экспериментах по интегральным и специфическим эффектам, позволяет определить, является ли сенсибилизирующее действие лимитирующим. С учетом этих данных обосновывают величину гигиенического норматива (см. раздел 6).

При нормировании сложных химических продуктов сенсибилизацию животных на обоих этапах исследования осуществляют цельным продуктом; при выявлении сенсибилизации для тестирования применяют все основные ингредиенты в чистом виде, а при неизвестном составе - цельный продукт или вытяжку из него (см. раздел 5.3).

^ 3. Постановка исследований по выявлению аллергенных свойств

3.1. Внутрикожная сенсибилизация морских свинок

В эксперименте используют молодых морских свинок массой 250 - 300 г, разделенных на 2 опытных и одну общую контрольную группы по 8 - 10 животных в каждой. Животных опытных групп сенсибилизируют, вводя однократно в кожу наружной поверхности уха ближе к его основанию 50 (1-я опытная группа) и 200 мкг на животное (2-я опытная группа) изучаемое вещество в объеме 0,02 - 0,1 мл. В качестве растворителей применяют дистиллированную воду, физиологический раствор, ацетон, спирт, твин-80, диметилсульфоксид и др. При изучении маслообразных продуктов используют водные эмульсии, а для отвержденных полимеров - вытяжки (см. раздел 5.3). Контрольным животным вводят в том же объеме растворитель, эмульгатор или экстрагирующую жидкость.

Выявление сенсибилизации (см. раздел 5) проводят через 8 - 10 дней. Сильные аллергены в обеих дозах вызывают у морских свинок выраженную сенсибилизацию: среднегрупповой показатель аллергологических тестов статистически достоверно отличается от такового у контрольных животных. Умеренные аллергены выраженную сенсибилизацию вызывают лишь при введении в дозе 200 мкг на животное, а при введении 50 мкг на животное - слабую, при которой сенсибилизация обнаруживается у 1/3 - 1/2 части животных, а среднегрупповые показатели аллергологических тестов могут не отличаться от таковых у контрольных животных. Слабые аллергены вызывают слабую сенсибилизацию лишь при введении вещества в дозе 200 мкг на животное, при этом положительными могут быть лишь тесты с клетками крови, а кожные пробы - отрицательными.

^ 3.2. Комбинированная сенсибилизация морских свинок

Сложные продукты и подтвержденные полимеры могут очень плохо всасываться, и в этом случае сенсибилизация у морских свинок не наступает даже при введении в кожу уха 200 мкг/жив. Для окончательного решения о наличии аллергенных свойств при отрицательных результатах аллергологического тестирования животных на следующий день начинают эпикутанные аппликации вещества. После 7-й аппликации повторно проводят тестирование морских свинок.

Концентрацию вещества для эпикутанных аппликаций подбирают в процессе изучения раздражающего кожу действия или в специальном эксперименте: 6 - 8 морским свинкам массой 250 - 300 г в течение 7 - 10 дней (по 5 раз в неделю) наносят по 3 капли изучаемого вещества и его разведений 1:2, 1:10 и 1:100 на выстриженные "окошки" боковой поверхности туловища размером 2 х 2 см. В качестве растворителя удобно использовать летучий не раздражающий кожу растворитель (ацетон, 70°-ный спирт, диметилсульфоксид). Если образуется пленка, то ее через 4 часа смывают, в остальных случаях кожу ничем не обрабатывают. Из нерастворимых веществ готовят мази (лучше на ланолине, а не на вазелине), которые распределяют глазной лопаточкой по поверхности "окошка". Для сенсибилизации выбирают максимальную концентрацию, не вызвавшую развития контактного дерматита.

^ 3.3. Определение ГЗТ на мышах

В опытную и контрольную группы берут по 10 мышей чистой линии (BALB/C, СА-1, ДВА/2) или по 16 - 20 белых беспородных мышей массой 18 - 20 г. Животных сенсибилизируют 10 мМ или 100 мкг изучаемого вещества однократно внутрикожно в основание хвоста. Сенсибилизирующая доза вещества эмульгируется в 60 мкл смеси полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) и раствора Хенкса рН 7,5, приготовленной в соотношении 1:1. Состав ПАФ: 1 мл ланолина, 3 мл вазелинового масла, 5 мг убитой нагреванием вакцины БЦЖ. В этот объем ПАФ добавляют 50 мкл твина-20 и 0,5 мл дистиллированной воды. Смесь автоклавируют. Контрольным животным вводят 60 мкл данной смеси без добавления изучаемого вещества.

Для выявления сенсибилизации через 5 суток в подушечку задней лапы мышей вводят такое же, как и при сенсибилизации, количество изучаемого вещества (10 мМ или 100 мкг), растворенного (взвешенного) в растворе Хенкса. Через 24 часа измеряют инженерным микрометром МК-0-25 толщину обеих задних лап в мм. О величине отека, т.е. о развитии ГЗТ судят по разнице в толщине обеих задних лап (показатель ГЗТ). У контрольных животных она, как правило, составляет 0,04 - 0,09 мм. Статистически достоверное превышение среднегруппового показателя ГЗТ опытных животных по сравнению с контрольными свидетельствует о наличии выраженных или умеренных сенсибилизирующих свойств у изучаемого соединения.

^ 3.4. Многократные эпикутанные аппликации на морских свинках

Подбор сенсибилизирующей концентрации осуществляют также, как при комбинированной сенсибилизации (см. раздел 3.2). Эпикутанные аппликации проводят по 5 раз в неделю в течение 4 недель (всего 20 аппликаций). Если на 2 - 3-й неделе опыта у морских свинок появляются признаки контактного дерматита, то сенсибилизирующие аппликации продолжают на другом участке кожи. Выявление сенсибилизации проводят через 1 - 2 суток после последней аппликации. При этом капельную кожную пробу ставят на противоположном боку.

^ 4. Постановка исследований по обоснованию величины гигиенических нормативов

4.1. Интратрахеальная сенсибилизация белых крыс

Двум группам белых крыс вводят однократно в трахею 0,5 - 1,0 мл суспензии максимально измельченной изучаемой пыли в дозах по 50 и 10 мг на подогретом до 37 °С физиологическом растворе. Животным контрольной группы вводят по 1 мл подогретого до 37 °С физиологического раствора.

Процедуру введения лучше осуществлять без наркоза. Для этого крысу фиксируют в вертикальном положении, вводят в ротовую полость металлический зонд, закрепленный на шприце с соответствующей дозой суспензии, проводят его по передней стенке гортани через голосовую щель (возникает ощущение препятствия) до упора в бифуркацию трахеи, слегка приподнимают зонд и осуществляют введение. После введения животное продолжают держать, в вертикальном положении на протяжении нескольких дыхательных движений. При этом хрипы и хлюпающий звук подтверждают проникновение суспензии в легкие.

Тестирование животных всех групп проводят через 5 суток после интратрахеального введения.

^ 4.2. Однократное ингаляционное воздействие

Однократные ингаляции вещества с целью определения величины Lim sens ас целесообразно проводить на морских свинках или белых крысах после нахождения величины Lim ас . Для слабых и умеренных аллергенов обычно достаточно проводить ингаляции изучаемого вещества в концентрациях на уровне действующей, пороговой и на порядок ниже таковой по общетоксическому эффекту. При изучении сильных аллергенов приходится еще проводить ингаляции в меньших концентрациях. Длительность каждой ингаляции составляет при установлении нормативов для воздуха рабочей зоны 4 часа, для атмосферного воздуха - 24 часа. Число животных в группе должно быть не менее 10.

Однократные ингаляции следует проводить на крысах с тем, чтобы можно было сравнить величины Lim sens ас и Lim ас , полученные на одном виде животных. Однако, если на крысах однократная ингаляция не вызывает сенсибилизации, то ее надо повторить на морских свинках.

Выявление сенсибилизации осуществляют через неделю после проведения ингаляции.

За Lim sens ас принимают концентрацию вещества, однократная ингаляция которой вызывает сенсибилизацию у 2 - 5 из 10 животных, проявляющуюся положительными лабораторными тестами и/или провокационными пробами. При этом среднегрупповые значения показателей сенсибилизации могут статистически достоверно не отличаться от контрольных.

^ 4.3. Многократное ингаляционное воздействие

Многократные ингаляции проводят на животных того же вида, на которых установили Lim sens ас . Продолжительность воздействия составляет: при установлении ПДК в воздухе рабочей зоны 4 часа ежедневно 5 раз в неделю в продолжении 2-х недель, для ПДК в атмосферном воздухе 14 суток непрерывного (круглосуточного) воздействия. Соответственно через 2 недели проводят первое тестирование животных. При отрицательном или сомнительном результате ингаляции продолжают еще 2 недели и том же режиме и проводят повторное тестирование. При установлении ПДК в воздухе рабочей зоны общая продолжительность воздействия не должна превышать одного месяца, а для атмосферного воздуха опыт может быть продолжен до 2-х месяцев. Более длительное воздействие нецелесообразно, поскольку оно не ведет к усилению сенсибилизирующего эффекта. Более того, последующие ингаляции могут привести к ослаблению эффекта из-за развития компенсаторных иммунных процессов и существенно затруднят определение пороговой концентрации. Таким образом, 2 - 4-недельный эксперимент по своему эффекту в принципе равнозначен хроническому токсикологическому эксперименту, что позволяет проводить сравнение величин Lim ch и Lim sens ch .

Определение пороговой концентрации по сенсибилизирующему эффекту (Lim sens ch ) проводят по тем же принципам, что и при однократном ингаляционном воздействии.

^ 5. Методы выявления сенсибилизации

В настоящем документе рекомендованы широко апробированные в токсикологической практике приемы выявления сенсибилизации к химическим соединениям и продуктам: кожные провокационные пробы и лабораторные специфические аллерготесты, основанные на реакции клеток крови на аллерген in vitro. Эти тесты позволяют выявить аллергические реакции разного типа: замедленные (провокационная капельная кожная проба), немедленные реагинового типа (тесты с тучными клетками), а также опосредованные иммунными комплексами (лизис лейкоцитов и тесты с нейтрофилами крови). Рекомендуемые тесты не должны ограничивать инициативу исследования, так как правомерно использование и других методов как специфической аллергодиагностики, так и неспецифических, свидетельствующих о развитии сенсибилизации у подопытных животных (иммунологических, биохимических, иммуноморфологических и др.).

^ 5.1. Провокационная кожная капельная проба на морских свинках

Для проведения кожной капельной пробы (далее - КП) предварительно проводят подбор тестирующей концентрации и изучаемого вещества на группе интактных морских свинок (6 - 8 особей). Для этого на боковых поверхностях туловища животного выстригают шерсть на 4 - 8 участках размером 1 х 1 см, разделенных полосками шерсти. На соответствующий участок наносят по 1 - 3 капли вещества в определенной концентрации. Обычно испытывают вещество в нативном виде и его двукратные или десятикратные разведения. В качестве растворителя (разбавителя) используют воду, 70°-ный спирт, ацетон, диметилсульфоксид. При этом один из участков кожи должен быть контрольным, на который наносят соответствующий растворитель (разбавитель). Реакцию учитывают визуально через 24 часа.

В качестве тестирующей концентрации выбирают максимальную, нанесение которой на кожу интактных морских свинок не вызывает через 24 часа реакцию раздражения (эритемы, опухания).

Постановка КП. На лишенную шерсти кожу бока морских свинок (опытных и контрольных) наносят по 1 капле изучаемого вещества в тестирующей концентрации. Реакцию оценивают визуально через 24 часа по следующей шкале:

0 баллов - видимой реакции нет;

1 балл - слабо-розовая эритема по всему участку или по периферии;

2 балла - ярко-розовая эритема по всему участку или по периферии;

3 балла - ярко-красная эритема по всему участку;

4 балла - опухание кожи с эритемой или без нее;

5 баллов - выраженное опухание, очаговые изъязвления, геморрагии.

^ 5.2. Провокационный тест опухания уха

Подбор тестирующей концентрации для ТОУ в принципе не отличается от такового для КП: используются те же растворители (ацетон, 70°-ный спирт) и разведения вещества (от 0,1 до 20%, реже 50% или неразведенный продукт). Однако общее число животных увеличивают, так как на одном животном можно испытывать только две концентрации (по одной на каждое ухо).

Постановка ТОУ: предварительно измеряют микрометром в мм толщину средней части ушной раковины, затем на обе поверхности средней трети расправленного и фиксированного пинцетом ушка наносят по 25 мкл испытуемого вещества в рабочей концентрации. Через 24 часа повторно замеряют толщину ушка и вычисляют показатель ТОУ по различию толщины до и после аппликации. ТОУ считают положительным у морских свинок и крыс при показателе 0,03 мм и более, у мышей - 0,01 мм и более. У морских свинок ТОУ можно учитывать в баллах по следующей шкале:

0 баллов - до 0,03 мм;

1 балл - 0,03 - 0,07 мм;

2 балла - 0,08 - 0,12 мм;

3 балла - 0,13 - 0,17 мм;

4 балла - 0,18 - 0,22 мм;

5 баллов - 0,23 мм и более.

^ 5.3. Подбор рабочих доз вещества для постановки специфических аллерготестов с клетками крови животных

Специфические аллерготесты с клетками крови, как правило, выполняют с 0,1 - 0,01%-ными растворами (на физиологическом растворе), поэтому в них можно использовать малорастворимые вещества. Для веществ, не растворяемых в воде даже в таких концентрациях, следует подобрать водорастворимое вещество, имеющее групповую антигенную детерминанту: например, для формальдегидсодержащих полимерных продуктов - растворы формальдегида; для полимерных продуктов, содержащих эпоксигруппы - эпихлоргидрин; для всех соединений хрома – CrCl 3 ; для металла Ве и его соединений - сульфат бериллия и т.д. При изучении отвержденных полимеров используют вытяжку: изучаемое вещество и физиологический раствор в соотношении 1:1 для полимеризационных и 1:10 для поликонденсационных продуктов при инкубации при 37 °С в течение 3 - 5 суток.

Растворы желательно приготавливать не из технических продуктов, а из химически чистых веществ. Поскольку кислая или щелочная среда может вызвать повреждение клеток крови, следует следить, чтобы рН рабочего раствора была нейтральной или слабо щелочной (рН 7,2 - 7,4). Если вещество образует нестойкий раствор, рабочие растворы необходимо готовить для каждого опыта. Стойкие растворы можно хранить в холодильнике и течение месяца, однако при этом следует следить за их стерильностью и в случае помутнения или образовании пленки раствор использовать нельзя.

Рабочие дозы (концентрации растворов) испытуемых веществ подбирают путем постановки теста с кровью интактных животных, используя несколько разведений. Для выявления сенсибилизации выбирают максимальную концентрацию раствора, не вызывающую увеличения лизиса или других соответствующих тесту изменений клеток крови по сравнению с контрольной пробой с добавлением только антикоагулянта.

^ 5.4. Реакция специфического лизиса лейкоцитов крови

Вариант 1. В первую пробирку или лунку планшета вносят 0,1 мл физиологического раствора (контрольная проба), во вторую - 0,1 мл физиологического раствора, в котором предварительно растворена рабочая доза испытуемого вещества (опытная проба). Затем в обе пробирки добавляют по 0,1 мл исследуемой крови. Реагирующие системы перемешивают встряхиванием и инкубируют в течение 2 часов при 37 °С. Из каждой пробы кровь переносят по 0,02 мл соответственно в две пробирки или лунки планшета, содержащие для разрушения эритроцитов по 0,4 мл 3%-ного водного раствора уксусной кислоты.

Вариант 2. В два меланжера до метки 0,5 набирают кровь экспериментальных животных, затем в первый меланжер до метки 1 добавляют 5%-ный раствор лимоннокислого натрия, приготовленный на физиологическом растворе (контрольная проба), во второй (до той же метки I) - 5%-ный раствор лимоннокислого натрия, в котором предварительно растворена рабочая доза испытуемого вещества (опытная проба). Меланжеры встряхивают и инкубируют при 37 °С в течение 2-х часов. Затем в оба меланжера до метки II набирают 3 - 5%-ный водный раствор уксусной кислоты, подкрашенный метиленовым синим.

Подсчет абсолютного количества лейкоцитов проводят в счетной камере крови или на пикаскеле. При использовании меланжеров до заполнения камеры предварительно сливают 3 - 4 капли.

Показатель РСЛЛ рассчитывают по формуле:

Реакцию расценивают как положительную при показателе лизиса лейкоцитов 10% и выше. Показатель РСЛЛ выше 20% свидетельствует о высоком уровне сенсибилизации животных.

Рабочие концентрации химических аллергенов не должны вызывать лизис более 9% лейкоцитов интактных животных и наиболее часто соответствуют 0,5 - 0,05%-ным разведениям на физиологическом растворе; более высокого разведения требуют вещества, обладающие выраженным раздражающим, а следовательно, цитотоксическим действием на клетки крови.

^ 5.5. Реакция специфического повреждения нейтрофилов

Для постановки реакции специфического повреждения нейтрофилов (далее - тест ППН) в качестве антикоагулянта применяют 5%-ный водный раствор цитрата натрия или 1,5%-ный раствор ЭДТА (Хелатон-3), приготовленный на физиологическом растворе (следить за рН раствора).

Рабочую концентрацию изучаемого вещества готовят на том же антикоагулянте, который добавляют к крови. Рабочая концентрация не должна вызывать повреждение более чем 4% нейтрофилов интактных животных в 1-м варианте теста ППН и 7% во 2-м варианте.

Постановка теста ППН. В первую силиконированную центрифужную пробирку (опытная проба) вносят 0,1 - 0,2 мл раствора изучаемого вещества в рабочей концентрации, во вторую (контрольная проба) - такой же объем только антикоагулянта. Затем в обе пробирки добавляют такой же объем крови обследуемого животного, после чего пробирки осторожно перемешивают и выдерживают в течение 1 ч при комнатной температуре.

Вариант 1. После окончания инкубации из обеих пробирок готовят на предметном стекле мазки средней толщины, которые фиксируют и окрашивают методом, используемым при окраске мазков для подсчета лейкоцитарной формулы. Под иммерсией просчитывают 100 нейтрофилов, учитывая число клеток с отчетливым хроматинолизом, пикнозом, фрагментацией ядер, гиперхроматозом или кариолизисом.

Вариант 2. После окончания инкубации снова осторожно перемешивают и добавляют в обе пробирки по 0,02 мл рабочего водного раствора акридина оранжевого (1:20000). Данный раствор хранят в холодильнике не более 2-х недель. Для его приготовления используют йодный раствор акридина оранжевого в разведении 1:100, который можно хранить в темном флаконе в холодильнике несколько месяцев. Через 5 минут по 1 капле содержимого из каждой пробирки переносят на два предметных стекла, накрывают покровным стеклом и через 3 - 5 минут исследуют в ЛЮМАМе с иммерсией. Подсчитывают 100 нейтрофилов, которые хорошо определяются благодаря обилию рубиновых гранул на фоне тусклого зеленого свечения цитоплазмы.

Нормальные неповрежденные нейтрофилы имеют овальную или круглую форму. Поврежденные нейтрофилы распознают по характерным амебоидным выпячиваниям (увеличение подвижности клеток) и морфологическим изменениям (неровные "разорванные" края с начинающимся разрежением цитоплазмы по краям клетки, вакуолизация цитоплазмы, дегрануляция, огрубление хроматинового рисунка ядра).

Показатель реакции высчитывают путем деления на 100 разницы в числе поврежденных нейтрофилов в опытной и контрольной пробах. Величина показателя 0,05 и более в первом варианте и 0,08 и более во втором варианте свидетельствует о сенсибилизации животного.

^ 5.6. Реакция специфической дегрануляции тучных клеток

Исследование выполняют под наркозом или сразу после декапитации животного. Для этого ножницами вскрывают брюшную стенку по средней линии и осторожно (лучше пальцами в резиновых напальчниках, а не пинцетом) вытягивают наружу наиболее длинную петлю перистальтирующего кишечника (5 см или несколько длиннее). Раскладывают петлю на подставленное предметное стекло так, чтобы раскрылись 3 крупных сегмента брыжейки. После этого отсекают с двух сторон участок петли кишечника, края которого должны на 0,5 см свешиваться за край стекла. Затем на каждый сегмент первого контрольного препарата наносят по 40 мкл физиологического раствора, а на каждый сегмент второго опытного препарата наносят по 20 мкл свежей аутосыворотки (приготовленной в день исследования из крови, взятой из подъязычной вены) и по 20 мкл изучаемого вещества в рабочей концентрации, приготовленной на физиологическом растворе. Оба препарата инкубируют 5 минут при 37 °С, удаляют жидкую фазу путем промокания фильтровальной бумагой края наклоненного стекла и при необходимости еще раз осторожно расправляют брыжейку. Сразу производят окраску препаратов, заливая их на 1 - 1,5 минуты 1%-ным раствором на метиловом спирте эозинметиленового красителя (по Май-Грюнвальду). Краску удаляют промыванием слегка наклоненного препарата водой из пипетки и оставляют до полного просушивания на воздухе (обычно 24 часа). На высушенном препарате скальпелем удаляют весь участок кишечника и перегородки между секторами брыжейки.

Микроскопируют препараты с иммерсией (увеличение 10 х 80), просчитывают по диагонали 50 тучных клеток, учитывая среди них поврежденные формы. Поврежденными следует считать тучные клетки с нарушенной мембраной и выходом гранул за ее пределы (дегрануляция), а также полностью поврежденные. Рассчитывают показатель РДТК по формуле:

Реакцию расценивают как положительную при показателе 1,31 и выше.

Рабочие концентрации химических веществ для РДТК наиболее часто соответствуют 0,01 - 0,001%-ным разведениям на физиологическом растворе, при действии которых у контрольных животных показатель ДТК не должен превышать 1,0  0,3.

^ 5.7. Реакция непрямой дегрануляции тучных клеток

Данный тест (далее - РНТДК) основан на реакции клеток-мишеней (тучные клетки белых крыс) на воздействие на них in vitro аллергических антител, содержащихся в сыворотке крови подопытных животных, и изучаемого вещества (аллергена).

Для получения пула тучных клеток интактным белым крысам под эфирным наркозом вводят внутрибрюшинно 6 - 10 мл подогретого до 37 °С физиологического раствора, смешанного с 0,5 мл гепарина. После легкого массажа брюшной стенки ножницами делают разрез длиной 1,5 - 2,2 см по средней линии живота, переворачивают тушку разрезом вниз и собирают экссудат, стекающий с петель кишечника, в центрифужную пробирку, смоченную гепарином. Экссудат центрифугируют в течение 5 мин. при 1500 об./мин., надосадок сливают, а осадок для получения взвеси тучных клеток перемешивают.

Для выполнения РНДТК в 2 лунки планшета или 2 пробирки вносят по 0,05 мл взвеси тучных клеток и 0,05 мл сыворотки обследуемого животного. Затем в 1-ю пробу (контрольную) добавляют 0,05 мл физиологического раствора, во 2-ю пробу (опытную) - 0,05 мл физиологического раствора, в котором растворена рабочая доза изучаемого вещества (0,01 - 0,001%-ные растворы, которые не должны вызывать спонтанного повреждения более 5% клеток-мишеней). Затем на одно обезжиренное предметное стекло, предварительно окрашенное на 2-х концах стекла в виде квадратов, 0,3%-ным спиртовым раствором нейтрального красного и высушенного при комнатной температуре, наносят по капле из каждой пробы. Каждую каплю накрывают покровным стеклом, края которого смазаны вазелином, и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин.

Препараты микроскопируют при увеличении 20 х 80. В каждом препарате подсчитывают 50 тучных клеток. Вычисление показателя РНДТК и его оценку проводят как и в разделе 5.6 при постановке РДТК.

^ 5.8. Оценка результатов выявления сенсибилизации

При проведении исследований I-го этапа оценивают частоту развития сенсибилизации и ее интенсивность по среднегрупповым показателям всех использованных провокационных и специфических аллергологических тестов. Класс аллергенной активности изучаемого вещества определяют по табл. 1: к 1-му классу относят сильные, ко 2-му - умеренные и к 3-му - слабые аллергены. В случае различия эффекта по частоте проявления сенсибилизации и величинам среднегрупповых показателей различных провокационных и/или специфических аллергологических тестов аллергенную активность вещества оценивают по наиболее выраженному показателю.

Таблица 1

^ КЛАССИФИКАЦИЯ ВЕЩЕСТВ ПО СИЛЕ АЛЛЕРГЕННОЙ АКТИВНОСТИ

При проведении ингаляционных экспериментов II этапа исследований за действующую концентрацию принимают такую, при действии которой сенсибилизация развивается более чем у половины животных, а среднегрупповые показатели аллергологических тестов статистически достоверно отличаются от таковых у контрольных животных. За пороги острого и хронического сенсибилизирующего действия принимают концентрации, при действии которых (одно- или многократно соответственно) сенсибилизация развивается у 2 - 5 из 10 животных, причем среднегрупповые показатели существенно не отличаются от таковых у контрольных животных.

^ 6. Обоснование величины гигиенических нормативов

Обоснование величины санитарного стандарта промышленного химического аллергена при проведении полной схемы исследований начинают со сравнения Lim sens ch с Lim ch . В зависимости от их соотношения определяют прием обоснования ПДК и наличие пометки А (аллерген).

При установлении ПДК в воздухе рабочей зоны руководствуются следующими положениями.

Если лимитирующим критерием является токсичность, т.е. величины порогов сенсибилизации выше величин порогов токсичности, то вещество практически не представляет опасности как аллерген, и его нормируют как обладающее общетоксическим действием; при этом пометка А (аллерген) не ставится.

Если пороговые величины общетоксического и сенсибилизирующего действия существенно не отличаются или равны, то вещество следует рассматривать как потенциально опасное в плане развития токсикоаллергических поражений и его нормируют по общетоксическому действию, сопровождая пометкой А (аллерген).

Если лимитирующим критерием является сенсибилизация, т.е. величины порогов сенсибилизации ниже пороговые величин токсичности, то вещество представляет опасность как этиологический фактор аллергических заболеваний, его расценивают как промышленный химический аллерген и нормируют по сенсибилизирующему действию с пометкой А (аллерген). При этом коэффициент запаса для химического аллергена определяют по табл. 2.

Таблица 2

^ КОЭФФИЦИЕНТЫ ЗАПАСА К Lim sens ch ПРИ УСТАНОВЛЕНИИ ПДК В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ

При установлении ПДК вредных веществ, обладающих сенсибилизирующим действием, в атмосферном воздухе рекомендуются более строгие критерии, учитывая, что воздействию подвергаются дети, люди пожилого возраста и лица, имеющие различные заболевания. В этом случае учитывают не только величину порога хронического сенсибилизирующего действия, но также зону хронического сенсибилизирующего действия, определяемую по формуле:

.

Далее в соответствии с величиной Z sens ch определяют коэффициент запаса к Lim sens ch по табл. 3 Полученную величину ПДК по сенсибилизирующему эффекту сравнивают с ПДК по общетоксическому действию и в качестве гигиенического норматива выбирают наименьшую величину ПДК. Пометку А (аллерген) ставят в соответствии с принципами обоснования ПДК в воздухе рабочей зоны.

Таблица 3

^ КОЭФФИЦИЕНТЫ ЗАПАСА К Lim sens ch ПРИ УСТАНОВЛЕНИИ ПДК В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ

Так, если величины порогов хронического, токсического и сенсибилизирующего совпадают и составляют 0,01 мг/м 3 , то Z sens ch будет равна 1,0. В этом случае согласно табл. 3 коэффициент запаса по сенсибилизирующему действию не может быть менее 3,0, а величина ПДК составит 0,003 мг/м 3 . Если по токсичности положен коэффициент запаса, равный 2,0, т.е. величина ПДК составит 0,005 мг/м 3 , рекомендуется наименьшая величина ПДК, т.е. 0,003 мг/м 3 . Но если в разбираемом примере коэффициент запаса по токсичности должен быть не менее 5,0, т.е. определенная по данному эффекту величина будет еще меньше (0,002 мг/м 3), то выбирается она.

При обосновании ОБУВ ускоренным методом, т.е. по величине рассчитывают зону сенсибилизирующего действия вещества по нижеприведенной формуле и уменьшают величину ОБУВ, рассчитанную по общетоксическому действию, во столько раз, сколько составляет Z sensас .

.

Так, если расчетным путем по токсичности определена величина ОБУВ как 0,2 мг/м 3 , а Z sens ас равна 4, то ОБУВ испытуемого вещества с учетом сенсибилизирующего действия составит 0,05 мг/м 3 (0,2:4). Пометку А (аллерген) ставят в соответствии с принципами, используемыми при обосновании ПДК.

При нормировании по аналогии в случае совпадения частоты и интенсивности сенсибилизации, вызванной веществом, с таковыми от воздействия референс-аллергена, ПДК или ОБУВ устанавливают на уровне величины норматива референс-аллергена с пометкой А (аллерген). При существенном отклонении частоты и интенсивности сенсибилизации по сравнению с таковыми от воздействия референс-аллергена проводят II этап исследований и руководствуются вышеизложенными положениями обоснования величины ПДК или ОБУВ.

Класс опасности определяют по общепринятым в профилактической токсикологии правилам.

Клинико-гигиеническую проверку безопасности величины ПДК, установленной в эксперименте на животных, осуществляют путем сравнения условий труда и состояния здоровья работающих с использованием общепринятых в профилактической токсикологии приемов, а также на основании эпидемиолого-аллергологического обследования работающих, включая выборочное специфическое иммуноаллергологическое тестирование с целью выявления частоты и выраженности сенсибилизации к данному производственному аллергену.

Приложение

(Справочное)

^ БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ СВЕДЕНИЯ

1. Постановка исследований по гигиеническому нормированию промышленных аллергенов в воздухе рабочей зоны. Методические рекомендации № 2121-80 от 23.01.1980. Минздрав СССР. Рига, 1980.

2. Временные методические указания по обоснованию предельно допустимых концентраций загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест № 4681-88. Минздрав СССР. М, 1989.

3. Методы лабораторной специфической диагностики профессиональных аллергических заболеваний химической этиологии. Методические рекомендации № 10-8/94 от 25.12.1979 Минздрав СССР. М, 1980.

4. Алексеева О.Г., Дуева Л.А. Аллергия к промышленным химическим соединениям. М.: Медицина, 1978. - 242 с.

5. Дуева Л.А., Коган В.Ю., Суворов С.В., Штеренгарц Р.Я. Промышленные аллергены. М. Центр Международных Проектов Госкомприроды СССР. М., 1989. - 203 с.

Изобретение относится к области лабораторной диагностики и может быть использован для экспресс-диагностики миксоматоза кроликов. Сущность способа состоит в том, что проводят реакцию специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) с использованием противомиксоматозной вакцины из штамма В-82, рассчитывают показатель РСЛЛ и при его значении 10% и более диагностируют миксоматоз. Техническим результатом является разработка способа, позволяющего провести ускоренную диагностику на ранней стадии заболевания, а также выявить бессимптомное течение миксоматоза. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к экспресс-методам диагностики миксоматоза.

Известны различные способы диагностики миксоматоза кроликов, в том числе обнаружение антигенов в пораженной коже с помощью флуоресцирующих антител, выявление антител, циркулирующих иммунных комплексов с использованием реакций связывания комплемента, реакции иммунодиффузии, реакции нейтрализации и иммуноферментного анализа (Гуненко В.В. и др. О диагностике и профилактике миксоматоза кроликов. Ветеринария, 1987, т.12, с.44-45). Недостатками известных способов являются трудоемкость, наличие дорогостоящего оборудования, невозможность определения наличия вируса в первые дни после заражения.

Целью изобретения является сокращение сроков обнаружения в организме животного возбудителя миксоматоза. Обнаружение возможно начиная с трех-шести часов после заражения.

Достижение поставленной цели основано на феномене немедленной активации, повышенной чувствительности и перенапряжении иммунокомпетентных клеток крови - лейкоцитов - на повторное воздействие вне организма того же антигена, который до этого внедрился в организм.

Способ диагностики миксоматоза кроликов осуществляется следующим образом. У исследуемого животного берут пробу крови. В опытную пробирку, содержащую 0,05 мл 3,8%-ного раствора цитрата натрия, вносят 0,1 мл исследуемой крови и рабочую дозу антигена - 0,05 мл вакцины против миксоматоза кроликов сухой живой культуральной из штамма "В-82" в разведении одна иммунизирующая доза на один мл физиологического раствора. Контрольную пробирку заполняют в том же объеме, но физиологический раствор - без антигена.

Пробирки инкубируют в термостате в течение двух часов при температуре +37°С, встряхивая через каждые 30 минут. Затем для разрушения эритроцитов из контрольной и опытной пробирки по 0,02 мл крови переносят в пробирки с 0,4 мл 3%-ного раствора уксусной кислоты и подкрашивают генцианвиолетом. Подсчитывают число лейкоцитов в обеих пробах в камере Горяева и рассчитывают показатель реакции специфического лизиса лейкоцитов (в процентах) по формуле:

РСЛЛ считают положительной при показателе 10% и выше.

В случае сильного лейкоцитоза, когда затруднительно провести подсчет лейкоцитов, исследуемые контрольные и опытные пробы крови, дополнительно разводят физиологическим раствором в соотношении 1:1 или 1:2.

Для определения рабочей дозы антигена (вакцины против миксоматоза кроликов сухой живой культуральной из штамма "В-82") отобрали десять здоровых кроликов. Кровь от каждого кролика разделили на три пробы. В три пробирки с 0,05 мл 3%-ного раствора цитрата натрия внесли по 0,1 мл исследуемой крови. Затем в первую пробирку внесли 0,05 мл антигена - вакцины против миксоматоза кроликов сухой живой культуральной из штамма "В-82" в разведении четыре иммунизирующих дозы препарата на один мл физиологического раствора, во вторую - 0,05 мл вакцины в разведении две иммунизирующих дозы на один мл физиологического раствора, в третью - 0,05 мл вакцины в разведении одна иммунизирующая доза на один мл физиологического раствора.

Пробирки инкубировали в течение двух часов при температуре +37°, встряхивая через каждые 30 минут. Затем для разрушения эритроцитов из контрольных и опытных пробирок по 0,02 мл крови перенесли в пробирки с 0,4 мл 3%-ного раствора уксусной кислоты и подкрасили генцианвиолетом. Далее подсчитали число лейкоцитов во всех пробирках в камере Горяева и рассчитали показатель реакции специфического лизиса лейкоцитов (в процентах) по формуле:

где Лк и Ло - абсолютное количество лейкоцитов в контрольной и опытной пробе.

РСЛЛ для здоровых кроликов должна быть ниже 10%. Результаты представлены в табл. 1.

Как видно из таблицы 1 РСЛЛ во всех пробах не превышала 10%, поэтому рациональнее в качестве рабочей дозы антигена взять разведение вакцины против миксоматоза кроликов, сухой живой культуральной из штамма "В-82" из расчета одна иммунизирующая доза на один мл физиологического раствора.

Для ретроспективной диагностики миксоматоза в неблагополучном хозяйстве исследовали кровь кроликов.

На основании результатов клинического состояния кроликов были сформированы 4 группы животных по 5 голов в каждой (табл.2).

Первая группа - кролики-вирусоносители, со скрытой формой миксоматоза - находились в контакте с больными, но без клинических изменений. У отдельных были заметны бесшерстные участки, свидетельствующие об миксомных узлах в прошлом.

Во вторую группу - клинически больные миксоматозом - отобрали больных кроликов с отеками век, оснований ушных раковин, аногенетальной области, спины, с узелковыми ограниченными образованиями в коже ушей, головы и век.

Кролики третьей группы были вакцинированы с целью установления динамики лизиса лейкоцитов с момента внедрения миксоматозного антигена в организм животного, и для выявления особенностей реакции лизиса лейкоцитов у вакцинированных по сравнению с вирусоносителями.

Кролики четвертой группы - клинически здоровы и не инфицированы вирусом миксоматоза, служат контролем.

У животных всех групп определяли показатель реакции специфического лизиса лейкоцитов. Для этого у животных брали пробы крови. Каждую пробу делили на опытную и контрольную. В опытную пробирку, содержащую 0,05 мл 3,8%-ного раствора цитрата натрия, вносили 0,1 мл исследуемой крови и рабочую дозу антигена - 0,05 мл вакцины против миксоматоза кроликов сухой живой культуральной из штамма "В-82" в разведении одна иммунизирующая доза на один мл физиологического раствора. Контрольную пробирку заполняли в том же объеме, но физиологический раствор - без антигена.

Пробирки инкубировали в термостате в течение двух часов при температуре +37°С, встряхивая через каждые 30 минут. Затем для разрушения эритроцитов из контрольной и опытной пробирки по 0,02 мл крови перенесли в пробирки с 0,4 мл 3%-ного раствора уксусной кислоты и подкрасили генцианвиолетом. Подсчитали число лейкоцитов в обеих пробах в камере Горяева и рассчитали показатель реакции специфического лизиса лейкоцитов (в процентах) по формуле:

где Лк и Ло - абсолютное количество лейкоцитов в контрольной и опытной пробе.

РСЛЛ считали положительной при показателе 10% и выше.

Результаты представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, скорость снижения процента лизиса лейкоцитов у вакцинированных кроликов в 3,2 раза больше, чем у кроликов-вирусоносителей со скрытой формой миксоматоза, и 2 раза больше, чем у клинически больных. У больных с клинической формой миксоматоза процент лизиса лейкоцитов за весь период наблюдений был очень высокий, достигал 60-77%.

В группе вакцинированных кроликов обнаруживали резкое увеличение процента лизиса лейкоцитов на третьи сутки. Это свидетельство того, что вакцины против миксоматоза кроликов сухой живой культуральной из штамма "В-82" вызывает состояние сенсибилизации лейкоцитов крови (ответственных за иммунитет) до образования в организме специфических антител.

Лизис лейкоцитов у интактных кроликов за весь период опыта не превышал 10%, т.е. находился в пределах нормы.

Исследование РСЛЛ позволяет диагнозцировать бессимптомное течение миксоматоза.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ диагностики миксоматоза кроликов, отличающийся тем, что проводят реакцию специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) с использованием противомиксоматозной вакцины из штамма В-82, рассчитывают показатель РСЛЛ и при его значении 10% и более диагностируют миксоматоз.

2. Способ диагностики миксоматоза кроликов по п.1, отличающийся тем, что при лейкоцитозе пробы крови перед подсчетом лейкоцитов разводят физиологическим раствором в соотношении 1:1 или 1:2.

18.01.2009, 17:36

Здравствуйте!
Прошу порекомендовать разрешение следующей ситуации. У меня проблемы с лечением зубов были всегда, не так давно мне нужно было удалить несколько зубов. Для обезболивания был использован септонест. После его введения поднялось давление до 190 и началась тахикардия 150 уд/мин. (мое давление 110) После укола тавегила, давление стало нормализовываться. На следующий день наблюдалась осиплость голоса. Врач считает, что мне противопоказаны анестетики: убестезин, ультракаин, септонест.
Поскольку зубы лечить все равно надо, как мне поступить?

19.01.2009, 00:06

До этого случая вы уже лечили зубы с анестезией? Прошлые введения анестетика тоже сопровождались такой реакцией или это впервые? Также интересует какая именно делалась анестезия и концентрация адреналина в использованном анестетике и наличие заболеваний сердечно-сосудистой системы
Подобная реакция может быть связана с попаданием анестетика в кровеносный сосуд (при некоторых видах анестезии существует вероятность попасть в кровеносный сосуд). Также такие симптомы могут быть реакцией на адреналин, входящий в состав анестетика.
У нас пациентов с непереносимостью местных анестетиков направляют в отделение хиургической стоматологии стационара, где обследуют и лечат под местной анестезией или под наркозом.

19.01.2009, 09:51

Спасибо за быстрый ответ! До этого во время небольших вмешательств применялся лидокаин, недавно удаляла родинку на лице с его применением. Перенесла хорошо, но и дозировка, видимо, была небольшая.
Септонест применялся два раза, второй я вам описала, а первый тоже в стоматологии, после чего было повышенным давление до 140 и в течение 5-6 часов не могла остановить кровотечение из зуба.
Из сердечно-сосудистых заболеваний есть экстрасистолическая аритмия.
Врач мне написала противопоказания: р-р убестезин 4 у, р-р ультракаин 2 у, р-р септонест. По концентрации адреналина, к сожалению, ответить не могу.

18.02.2009, 18:33

Здравствуйте,
сделала иммунологический анализ на анестетики и вот такие результаты получились:

1. Ультракаин Д-С - 81 (11%)
2. Ультракаин Д-С форте - 61 (32%)
3. Анреналин - 64 (29%)
4. Лидокаин - 58 (36%)
5. Скандонест - 76 (16%)
6. Убестезин форте - 58 (36%)
7. Септанест с андреналином - 65 (28%)
По степени активности:

Получается, что эти препараты применять нельзя (все >10%) при анестезии в стоматологии. И что теперь можно предпринять?

18.02.2009, 21:12

Я Вам намекну в отношении ценности проведенного анализа:

"Реакция специфического лейкоцитолиза показала изменение количество лейкоцитов по отношению к контролю 91 (100%) с препаратами:
...
4. Лидокаин - 58 (36%)
...
лизис до 11% - слабоположительный
лизис до 21%-40% - умеренноположительный
лизис до 41%-100% - резкоположительный

До этого во время небольших вмешательств применялся лидокаин, недавно удаляла родинку на лице с его применением. Перенесла хорошо

Полякова Ольга Николаевна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ

ТУБЕРКУЛЕЗА ЖИВОТНЫХ

06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

Микология с микотоксикологией и иммунология

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

Кандидата ветеринарных наук

Новочеркасск - 2011

Работа выполнена в Государственном научном учреждении

Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный

Институт Российской академии сельскохозяйственных наук

Научный руководитель: Доктор ветеринарных наук, профессор

Дубовой Борис Лаврентьевич

Официальные оппоненты: Доктор ветеринарных наук Попов М.А.

Доктор ветеринарных наук,

Доцент Хабузов И.П.

Ведущая организация : ГНУ Прикаспийский зональный научно-

Исследовательский ветеринарный институт

Россельхозакадемия

На заседании диссертационного совета Д 006.106.01 при Государственном научном учреждении Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук.

346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Северо-Кавказский зональный Научно-исследовательский ветеринарный институт Россельхозакадемии – 346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0.

Ученый секретарь

диссертационного совета, д.б.н. А.М. Ермаков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Борьба с туберкулезом животных – важнейшая проблема. Ликвидация туберкулеза животных имеет не только ветеринарное, но и экономическое и эпидемиологическое значение.

Наиболее важным в системе противотуберкулезных мероприятий является своевременное выявление зараженных животных и удаление их из стада как источника возбудителя туберкулеза.

В связи с этим при постановке диагноза на туберкулез особенно важна дифференциация специфических и неспецифических реакций на внутрикожное введение туберкулина.

Одной из важнейших задач профилактики туберкулеза сельскохозяйственных животных является совершенствование диагностики, так как существующие методы не обеспечивают обнаружение больных животных в начальной стадии болезни.

Проблема совершенствования диагностики туберкулеза животных имеет своей целью поиск способа ранней доклинической диагностики болезни и решения ряда задач, связанных с дифференциальной диагностикой туберкулеза, туберкулиновых реакций, вызванных сенсибилизацией организма атипичными микобактериями и птичьим видом. Поэтому необходим способ диагностики, который в кратчайший срок поможет выявить инфицированное и больное животное и предотвратить неоправданный и необоснованный убой высокопродуктивных животных.

Цель исследования - разработать способ ранней диагностики туберкулеза животных и дифференциации специфических и неспецифических реакций на внутрикожное введение туберкулина.

Достижение намеченной цели осуществлялось решением следующих задач:

1) определить рабочую дозу аллергена;

2) изучить специфичность и активность реакции лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) in vitro с аллергенами: ППД–туберкулином для млекопитающих, ППД–туберкулином для птиц и КАМ;

3) исследовать возможность использования реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) для дифференциации специфических и неспецифических реакций у положительно реагировавших на туберкулин коров.

Научная новизна. Разработан способ ранней диагностики туберкулеза, позволяющий в течение суток после заражения выявить инфицированное животное и дифференцировать туберкулиновые специфические реакции от неспецифических. Использование реакции специфического лизиса лейкоцитов с ППД–туберкулином для млекопитающих, ППД–туберкулином для птиц и КАМ позволило выявить неспецифическую сенсибилизацию организма, вызванную атипичными микобактериям.

Научная новизна подтверждена патентом на изобретение №2366454 «Способ ранней диагностики туберкулеза животных».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Ранняя диагностика туберкулеза животных.

2. Дифференциация туберкулиновых реакций.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на ежегодных научно-практических конференциях ФГОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет», ГНУ Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт РАСХН в 2006-2010 гг. и на всероссийских и международной научно-практических конференциях гг. Махачкала, Казань, Новочеркасск.

Реализация результатов исследований. Результаты исследований используются при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по эпизоотологии в ФГОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет», проходят апробацию в областной ветеринарной лаборатории, СББЖ г. Новочеркасска, СПК «Рассвет», Матвеево-Курганского района, ОАО «Южное», Сальского района и СПК «Советинский», Неклиновского района, Ростовской области.

Публикации по теме. По материалам диссертационной работы опубликовано 15 научных работ, три из них - в рецензируемом издании, рекомендованном ВАК РФ и патент РФ на способ диагностики.

Практическая значимость. Полученный научный материал позволяет обнаружить инфицированное животное в первые сутки после заражения и отличить положительные неспецифические туберкулиновые реакции, вызванные атипичными и птичьими микобактериями от специфических, что имеет важное практическое значение для сохранения животных с неспецифическими туберкулиновыми реакциями. РСЛЛ рекомендуется применять при ретроспективной диагностике туберкулеза и дифференциальной диагностике специфических и неспецифических реакций на введение ППД–туберкулина для млекопитающих при внутрикожной туберкулиновой пробе.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 153 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы. В диссертации приведены 28 таблиц. Список литературы включает 264 источника, в том числе 58 иностранных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований. Работу проводили на кафедре эпизоотологии ФГОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет», в учхозе «Донское» (ДонГАУ, пос. Персиановский), в лаборатории ГНУ СКЗНИВИ, в промышленном районе города Новочеркасска, в хозяйствах Матвеево-Курганского, Неклиновского и Сальского районов Ростовской области.

Для проведения опытов отобрали животных (крупный рогатый скот, свиней, собак и кроликов), у которых физиологические и гематологические показатели находились в пределах нормы. Были сформированы пять опытных и одна контрольная группа животных. Контрольную группу сформировали для сравнения с опытной для доказательства специфичности реакции. Каждая опытная и контрольная группа состояла из пяти животных.

В процессе выполнения работы изучали гематологические показатели свежей крови (количество лейкоцитов) и реакцию специфического лизиса лейкоцитов крупного рогатого скота, свиней, собак, кроликов.

Животных опытных групп разделили на пять групп в зависимости от дозы вводимой вакцины, чтобы определить интенсивность реакции. После введения животным опытных групп живых микобактерий вакцины БЦЖ, а животным контрольных групп вакцины против бруцеллеза шт.82 брали кровь. Кровь от животных при каждом заборе делили на опытные и контрольные пробы. Контрольные пробы - кровь с добавлением 3,8% раствор цитрата натрия и физиологическим раствором, опытные пробы – кровь с добавлением 3,8% раствора цитрата натрия с ППД-туберкулином для млекопитающих, ППД-туберкулином для птиц и КАМ.

В опытных и контрольных пробах подсчитывали количество лейкоцитов, чтобы в последующем определить процент лизиса лейкоцитов по формуле.

Подбор рабочей дозы аллергенов выполняли с кровью животных, у которых физиологические и гематологические показатели находились в пределах нормы, выбирая дозу, при которой, процент лизиса лейкоцитов был не более 10. Предположительный поиск аллергена находился в дозе от 0,05 до 0,15 мл.

Для постановки реакции специфического лизиса лейкоцитов использовали существующую методику определения количества лейкоцитов в крови. Подсчитывали количество лейкоцитов в опытных и контрольной пробах, рассчитывали процент лизиса лейкоцитов по формуле.

В опытную лунку планшета, содержащую 0,05 мл 3,8%-ного раствора цитрата натрия вносили 0,1 мл исследуемой крови и рабочую дозу аллергена 0,05мл. Контрольную лунку с кровью заполняли в том же объеме, но с физиологическим раствором вместо аллергена.

Пробы крови с туберкулинами, КАМ и физиологическим раствором инкубировали в термостате в течение 2 часов при +37°С, периодически легко встряхивая. Затем для разрушения эритроцитов из контрольной и трех опытных лунок брали по 0,02 мл крови и переносили в лунки планшета содержащие 0,4мл жидкости Тюрка. Подсчитывали число лейкоцитов (в камере Горяева) во всех пробах.

Затем рассчитывали процент лизиса лейкоцитов по формуле:

РСЛЛ = Лк-Ло * 100%

Где Лк и Ло – абсолютное количество лейкоцитов в контрольной и опытной пробе крови при единовременном заборе.

РСЛЛ считали положительной при показателе 10% и более.

При моделировании туберкулезного процесса для определения активности и специфичности реакции было сформировано шесть групп животных: пять опытных и одна контрольная.

Каждой опытной группе была введена определенная дозы живых микобактерий вакцины БЦЖ. Животным контрольной группы была введена одна доза противобруцеллезной вакцины шт. 82. В момент введения и через каждые 24 часа от животных брали кровь, делили ее на пробы с добавлением в нее 3,8% раствора цитрата натрия и диагностикумов для определения процента лизиса лейкоцитов, исследования чувствительности, активности и специфичности реакции.

В хозяйствах от реагировавших на туберкулин коров исследовали кровь реакцией специфического лизиса лейкоцитов. Взятую кровь делили на опытные пробы с добавлением ППД-туберкулина для млекопитающих, ППД-туберкулина для птиц, КАМ и контрольную пробу с физиологическим раствором. Подсчитали количество лейкоцитов во всех пробах и рассчитали показатель РСЛЛ.

После исследования реакции специфического лизиса лейкоцитов был проведен контрольно-диагностический убой коров, положительно реагировавших на туберкулин и послеубойная ветеринарно-санитарная экспертиза туш и внутренних органов для обнаружения патологоанатомических изменений, характерных при заболевании и для изучения этиологии вызывающих положительные реакции туберкулиновых проб при неспецифических реакциях.

Учитывали, какая доля положительных туберкулиновых проб совпадает с результатами РСЛЛ, с патологоанатомическими изменениями, характерными для туберкулеза. Какая доля составляет совпадение положительных туберкулиновых проб, РСЛЛ и патологоанатомических изменений, несвойственных туберкулезу. Сколько положительных туберкулиновых проб совпадает в РСЛЛ с ППД-туберкулином для млекопитающих, с ППД-туберкулином для птиц и КАМ. Сколько положительных туберкулиновых проб совпадает с эхинококкозом, установленным при патологоанатолическом исследовании туш убитых с диагностической целью коров.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Определение рабочей дозы ППД –туберкулина для млекопитающих, ППД-туберкулина для птиц и КАМ

Рабочую дозу диагностических аллергенов отрабатывали на цитратной крови животных, у которых физиологические и гематологические показатели находились в пределах нормы. Аллерген использовали в дозе 0,05мл, 0,1мл и 0,15мл и в таких же объемах брали физиологический раствор.

Рабочая доза не должна вызывать разрушение лейкоцитов и сенсибилизацию к аллергену, антигену и диагностическим препаратам.

В таблице показано объемное соотношение туберкулинов и КАМ с кровью и 3,8% раствором цитрата натрия.

В опытных и контрольной пробах подсчитывали количество лейкоцитов и по формуле рассчитывали процент лизиса лейкоцитов.

Реакция специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) во всех пробах крови с аллергенами у крупного рогатого скота, свиней и кроликов доходила до 3% , у собак - до 7 %. Поэтому экономнее в качестве рабочей дозы использовать дозу 0,05 мл аллергена (туберкулина или КАМ), т.к. РСЛЛ у нее оказалась ниже, чем при дозе 0,15мл. И величина ее была практически одинаковой для ППД – туберкулина для млекопитающих, ППД – туберкулина для птиц и КАМ.

Рабочая доза туберкулинов и КАМ для РСЛЛ была взята 0,05 мл, так как она оказалась экономична и не вызывала разрушения лейкоцитов.

Таблица 1.

Определение рабочей дозы туберкулинов и КАМ.

3.2. Изучение специфичности и активности реакции специфического

лизиса лейкоцитов

3.2.1. Изучение специфичности и активности РСЛЛ крови крупного

рогатого скота

Опыт проводили в учхозе «Донское», Октябрьского района Ростовской области.

Для исследований отобрали тридцать голов молодняка крупного рогатого скота в возрасте четырех – шести месяцев.

Были сформированы пять опытных и одна контрольная группа животных. В каждую группу взяли по пять животных.

Животным опытных групп вводили живые микобактерии вакцинного штамма БЦЖ в прививочных дозах: одна, три, пять, семь, десять. Бычкам контрольной группы была введена одна доза вакцины против бруцеллеза из шт. 82. Затем от всех животных брали кровь для исследования реакцией специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ).

Сенсибилизированные микобактериями вакцины БЦЖ в организме лейкоциты приобретают повышенную чувствительность к антигену и при встрече вне организма (in vitro) с подобным аллергеном лизируются.

В день введения животным вакцины БЦЖ количество лейкоцитов (в среднем по группе) вне организма в пробах крови при взаимодействии с ППД–туберкулином для млекопитающих, ППД–туберкулином для птиц и КАМ было практически одинаковым, что свидетельствует об отсутствии сенсибилизированных лейкоцитов микобактериями БЦЖ.

Через 24 часа после введения вакцины БЦЖ количество лейкоцитов (в среднем по группе) в пробах крови вне организма с ППД–туберкулином для млекопитающих уменьшалось в результате их лизиса, вызванного взаимодействием сенсибилизированных клеток с аллергеном. При введении бычкам одной иммунной дозы вакцины БЦЖ количество лейкоцитов составило 9,0·10 9 /л (Табл.№2), трех доз – 8,6·10 9 /л, пяти доз – 8,7·10 9 /л, семи доз – 8,6·10 9 /л, десяти доз – 7,1·10 9 /л (Р
В пробах крови с физиологическим раствором, ППД–туберкулином для птиц и КАМ количество лейкоцитов через 24 часа увеличивалось под воздействием вакцины БЦЖ на организм. При исследовании проб крови с физиологическим раствором вне организма от животных, которым инъецировали по одной дозе вакцины БЦЖ количество лейкоцитов (в среднем по группе) составило 10,5·10 9 /л, трех доз – 10,2·10 9 /л, пяти доз – 10,9 ·10 9 /л, семи доз – 12,0 ·10 9 /л, десять доз – 12,0·10 9 /л. Процент лизиса лейкоцитов в пробах крови с ППД–туберкулином для птиц и КАМ отсутствовал. Увеличение связано с реакцией организма на введенную вакцину и сопровождается лейкоцитозом. Сенсибилизированные БЦЖ лейкоциты не вступают in vitro во взаимодействие с неродственным аллергеном. Это указывает на специфичность РСЛЛ.

Во всех опытных группах животных количество лейкоцитов в пробах крови с физиологическим раствором, ППД–туберкулином для птиц и КАМ через 48 часов достигало максимального уровня. Число лейкоцитов (в среднем по группе) в пробах, содержащих физиологический раствор, ППД–туберкулин для птиц и КАМ составило при введении одной иммунной дозы БЦЖ 11,3·10 9 /л, трех доз – 11,6·10 9 /л, пяти доз – 12,1·10 9 /л, семи доз – 13,3 ·10 9 /л, десяти доз – 14,5·10 9 /л. И после 72 часов медленно начинало снижаться.

Таблица 2.

Количество лейкоцитов и показатели РСЛЛ в крови у крупного рогатого скота сенсибилизированных 1 дозой вакцины БЦЖ.

С увеличением иммунной дозы БЦЖ количество сенсибилизированных лейкоцитов в пробах крови возрастает и при взаимодействии их in vitro с ППД–туберкулином для млекопитающих они разрушаются, в результате процент лизиса лейкоцитов увеличивается.

Через 48 часов in vitro в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих в результате лизиса происходило снижение количества лейкоцитов. При введении одной иммунной дозы БЦЖ животным число лейкоцитов при повторной встрече с аллергеном in vitro (в среднем по группе) составило 8,2·10 9 /л, трех доз – 8,0·10 9 /л, пяти доз – 7,9 ·10 9 /л, семи доз – 7,7·10 9 /л, десяти доз – 7,5·10 9 /л. Реакция специфического лизиса лейкоцитов in vitro определялась для одной иммунной дозы на животное - 27%, трех доз – 31%, пяти доз – 35%, семи доз – 42%, десяти доз – 48%. Через 72часа лизис лейкоцитов достигал при одной иммунной дозы на животное - 23%, трех доз – 28%, пяти доз – 31%, семи доз – 37%, десяти доз – 41%.

После 72 часов реакция специфического лизиса лейкоцитов снижалась во всех подопытных группах животных.

Количество лейкоцитов в крови крупного рогатого скота в последующие дни (3-7-й день) снижалось и приходило к первоначальной величине (отмеченной в день вакцинации вакциной БЦЖ) при введении одной, трех доз на 6-й день (144часа), пяти, семи доз – 7-й день (168часов) и десяти доз на 8-й день (192часа).

В пробах крови бычков, содержащих ППД-туберкулин для птиц и КАМ показатели РСЛЛ во все дни опытов были отрицательными, лизис лейкоцитов отсутствовал. Результаты свидетельствуют о специфичности реакции.

Большой процент лизиса лейкоцитов наблюдается в пробах крови животных, содержащих ППД-туберкулин для млекопитающих, а процент лизиса лейкоцитов в пробах крови содержащих ППД-туберкулин для птиц и КАМ не превышал 3%, то есть был ниже учитываемого порога. Так как лейкоциты, сенсибилизированные микобактериями БЦЖ, in vitro под воздействием специфического родственного аллергена разрушаются.

Активность РСЛЛ характеризуется тем, что при повышении дозы живых микобактерий вакцинного шт. БЦЖ от 0,05 мг до 0,50 мг на животное, увеличивается количество сенсибилизированных лейкоцитов и возрастает процент лизиса лейкоцитов.

С увеличением процента лизиса лейкоцитов в зависимости от введенной прививочной дозы вакцины БЦЖ наблюдается повышенная интенсивность и продолжительность реакции специфического лизиса лейкоцитов.

Выполненные исследования с введением живых микобактерий вакцинного шт. БЦЖ бычкам, позволили установить специфичность и активность реакции специфического лизиса лейкоцитов, что необходимо для дифференциальной диагностики специфических реакций и к другому аллергену, реакция специфического лизиса лейкоцитов с ППД–туберкулином для млекопитающих, ППД–туберкулином для птиц и КАМ была отрицательной, так как количество лейкоцитов в опытных пробах крови с туберкулинами и КАМ, а также в контрольных пробах с физиологическим раствором было практически одинаковым.

Отсутствие реакции лизиса лейкоцитов у вакцинированных животных вакциной против бруцеллеза шт.82 с ППД–туберкулином для млекопитающих также указывает на специфичность реакции лизиса лейкоцитов, так как в пробах крови находятся лейкоциты, сенсибилизированные другим неродственным аллергеном.

3.2.2. Изучение специфичности и активности РСЛЛ крови свиней

при введении живых микобактерий вакцины БЦЖ

Для опыта были отобраны 30 голов поросят трехмесячного возраста, принадлежащих гражданам города Новочеркасска.

Поросят разделили на пять групп по 5 голов в каждой, которым подкожно инъецировали по одной, две, три, четыре и пять прививочных доз вакцины БЦЖ.

Количество лейкоцитов (в среднем по группе) у свиней в день введения микобактерий вакцины БЦЖ во всех пробах колебалось от 10,7 до 10,9·10 9 /л, т.е. было в физиологических пределах.

Через 24 часа после введения вакцины в пробах крови с физиологическим раствором, ППД–туберкулином для птиц и КАМ количество лейкоцитов было примерно одинаковым. При введении одной иммунной дозы 11,8 - 11,9·10 9 , двух доз 13,2·10 9 , трех доз 14,8 - 14,9·10 9 , четыре доз 15,4 - 15,5·10 9 , пяти доз 15,8 - 15,9·10 9 , т.к. сенсибилизированные лейкоциты в реакцию с физиологическим раствором и неродственными аллергенами не вступают, и лизис лейкоцитов отсутствует.

В пробах крови от вакцинированных БЦЖ поросят, несмотря на лейкоцитоз в организме, in vitro в пробах крови при взаимодействии с ППД–туберкулином для млекопитающих количество лейкоцитов стало уменьшаться через 24 часа в результате лизиса сенсибилизированных клеток при встрече с родственным аллергеном. При введении поросятам одной иммунной дозы вакцины БЦЖ, количество лейкоцитов in vitro (в среднем по группе) равнялось 10,5·10 9 /л, двух, трех, четырех доз – 10,0 ·10 9 /л, пяти доз - 9,9 ·10 9 /л (Р
Через 48 часов количество лейкоцитов в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих in vitro достигло минимального значения. Затем количество лейкоцитов увеличивалось. Лизис лейкоцитов составил соответственно введенным дозам 33%, 41%, 47%, 52%, 55%. Через 48 часов отмечался наибольший процент лизиса лейкоцитов в опытных пробах.

В пробах крови, содержащих физиологический раствор, ППД-туберкулин для птиц и КАМ, количество лейкоцитов повышалось и достигло своего максимального значения через 48 часов с момента введения поросятам вакцины БЦЖ. С увеличением дозы введенной вакцины БЦЖ увеличивалось количество лейкоцитов в пробах крови, содержащих физиологический раствор, ППД–туберкулин для птиц и КАМ, то есть возрастание дозы микобактерий БЦЖ сопровождалось увеличением лейкоцитоза в организме, следовательно, повышалось количество лейкоцитов в пробах крови с неспецифическими аллергенами (опытные пробы) и с физиологическим раствором (контрольная проба). Затем (через 72 часа) наблюдали снижение числа лейкоцитов, в этих пробах крови.

У вакцинированных свиней положительные показатели РСЛЛ в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих обнаруживали через 24 – 120 часов после введения одной, двух, трех, четырех доз и через 24-144 часа при пяти прививочных дозах вакцины БЦЖ.

В опытах, проведенных на поросятах, количество лейкоцитов в пробах крови, содержащих ППД–туберкулин для птиц и КАМ, было аналогичным, как в пробах с физиологическим раствором. РСЛЛ в пробах крови с ППД–туберкулином для птиц и КАМ была отрицательной, что подтверждает специфичность РСЛЛ с ППД–туберкулином для млекопитающих.

У свиней, вакцинированных вакциной против бруцеллеза шт. 82, количество лейкоцитов в пробах крови с туберкулином и физиологическим раствором было практически одинаковым, следовательно, РСЛЛ с ППД – туберкулином для млекопитающих, ППД – туберкулином для птиц и КАМ была отрицательной, т.к. лейкоциты, сенсибилизированные другим аллергеном в реакцию с физиологическим раствором и неродственными аллергенами не вступают и лизис лейкоцитов отсутствует. Это свидетельствует о специфичности реакции.

3.2.3. Изучение специфичности и активности РСЛЛ крови собак

при введении живых микобактерий вакцины БЦЖ

Опыты проводили на собаках, принадлежащих гражданам города Новочеркасска Ростовской области.

Сформировали пять опытных и одну контрольную группу животных. В каждой группе находилось по 5 собак.

Для проведения исследований собакам подкожно инъецировали одну (0,05мл), две (0,1мл), три (0,15мл), четыре (0,2мл) и пять (0,25мл) прививочных доз вакцины БЦЖ. Животным контрольной группы вводили одну дозу вакцины против бруцеллеза шт. 82.

В день введения вакцины БЦЖ количество лейкоцитов во всех пробах крови по группам in vitro было практически одинаковым.

Через 24 часа после введения животным микобактерий БЦЖ при взаимодействии крови с физиологическим раствором вне организма количество лейкоцитов (в среднем по группе) составило при введении одной прививочной дозы вакцины БЦЖ - 6,1·10 9 /л, двух доз - 6,9·10 9 /л, трех доз - 7,4·10 9 /л, четырех доз - 7,7·10 9 /л, пяти доз - 8,3·10 9 /л. В пробах крови с ППД–туберкулином для птиц и КАМ были получены данные, близкие к таковым в пробах крови с физиологическим раствором. Обнаруживали лейкоцитоз, так как организм реагирует на введение вакцины БЦЖ, и сенсибилизированные лейкоциты не вступают во взаимодействие с неродственными антигенами.

При дальнейшем исследовании обнаружили, что через 48 часов количество лейкоцитов (в среднем по группе) в пробах крови in vitro, содержащих физиологический раствор, достигло максимального уровня, при введении одной иммунной дозы вакцины - 6,2·10 9 /л; двух доз - 7,4·10 9 /л; трех доз - 8,5·10 9 /л; четырех доз - 9,5·10 9 /л; пяти доз - 10,8·10 9 /л. Количество лейкоцитов в пробах крови, содержащих физиологический раствор, было большим в два и более раза по сравнению с количеством лейкоцитов в день введения вакцины. Затем количество лейкоцитов начинало повышаться. Угасание реакции связано с вырабатыванием иммунной системой нормальных антител.

В среднем по группе число лейкоцитов в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих уменьшается и достигает минимума через 48 часов при введении одной дозы БЦЖ - 4,6·10 9 /л; двух доз - 3,8·10 9 /л; трех доз - 3,4·10 9 /л; четырех доз - 3,3·10 9 /л; пяти доз - 3,1·10 9 /л. Лизис лейкоцитов в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих был наибольшим и составил при введении одной дозы БЦЖ - 26%, двух доз - 49%, трех доз - 60%, четырех доз - 65%, пяти доз - 71%. Чем выше доза введенной вакцины БЦЖ, тем больший процент лизиса лейкоцитов. При введении больших доз возбудителя в организме наступает сильная аллергия и больше сенсибилизированных лейкоцитов разрушается при встрече с родственным (специфическим) антигеном, что видно из опытов в РСЛЛ вне организма.

Установлено, что через 72 часа количество лейкоцитов (в среднем по группе) в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих увеличивалось, а в пробах с физиологическим раствором с ППД–туберкулином для птиц и КАМ уменьшалось. Процент лизиса лейкоцитов через 72часа в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих равен при введении одной иммунной дозы 23%, двух доз - 39%,трех доз - 50 %, четырех доз - 60%, пяти доз - 64%.

Положительные показатели реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) в пробах крови, содержащих ППД-туберкулин для млекопитающих, отмечали при введении одной дозы вакцины БЦЖ через 24 – 96 часов, двух доз - через 24 -120 часов, трех доз - 24 – 120 часов, четырех доз 24 – 168 часов, пяти доз 24 – 240 часов.

Активность реакции специфического лизиса лейкоцитов характеризуется тем, что с повышением введенной дозы живых микобактерий вакцинного шт. БЦЖ животному возрастает показатель РСЛЛ и продолжительность сенсибилизации лейкоцитов.

Реакция специфического лизиса лейкоцитов в пробах крови опытных групп, содержащих ППД-туберкулин для птиц и КАМ, была отрицательной и колебалась до 3%.

У вакцинированных собак одной дозой противобруцеллезной вакцины реакция специфического лизиса лейкоцитов в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих, ППД–туберкулином для птиц и КАМ была отрицательной. Количество лейкоцитов в опытных и контрольных пробах крови с туберкулинами, КАМ и физиологическим раствором было практически одинаковым, что указывает на специфичность реакции лизиса лейкоцитов, так как в пробах крови сенсибилизированные лейкоциты не вступают во взаимодействие с неродственными антигенами.

3.2.4. Изучение специфичности и активности РСЛЛ крови кроликов

при введении живых микобактерий вакцины БЦЖ

Для поведения опытов отобрали 15 кроликов и разделили их на три группы.

После введения пяти, десяти доз микобактерий вакцины БЦЖ кроликам опытных групп и одной дозы вакцины противобруцеллезной шт. 82 животным контрольной группы, была взята кровь и разделена на пробы.

При исследовании установлено, что в день введения вакцины количество лейкоцитов во всех группах составило 7,9– 8,8·10 9 /л.

В пробах крови от кроликов, вакцинированных пятью дозами живых микобактерий вакцины БЦЖ, с физиологическим раствором в момент введения вакцины, количество лейкоцитов в среднем по группе было 8,8·10 9 /л. Затем количество лейкоцитов увеличивается и через 24 часа составило 11,3·10 9 /л, а через 48 часов достигает максимального уровня - 16,1·10 9 /л. Это связано с усилением функциональной деятельности кроветворных органов, вызванной поступающими в организм антигенами - микобактериями БЦЖ.

При взаимодействии крови вне организма с ППД–туберкулином для млекопитающих через 24 часа наблюдали самое низкое содержание лейкоцитов. Реакция специфического лизиса лейкоцитов через 24 часа равна 58%, через 48 часов - 71,4%, 72 часа - 70,5%. Максимальный процент лизиса лейкоцитов был зарегистрирован через 48 часов, затем процент лизиса лейкоцитов уменьшался. Положительная РСЛЛ с ППД–туберкулином для млекопитающих наблюдалась через 24 - 96 часов.

Количество лейкоцитов в пробах крови с ППД–туберкулином для птиц и КАМ было аналогичным, как и в пробах крови с физиологическим раствором. Реакция специфического лизиса лейкоцитов с ППД–туберкулином для птиц и КАМ была отрицательна (от -1% до 1%), что свидетельствует о специфичности реакции, так как сенсибилизированные лейкоциты не вступают во взаимодействие с чужеродными аллергенами.

Исследованиями установлено, что при введении десяти доз живых микобактерий вакцины БЦЖ, через 24 и 48 часов наименьшее количество лейкоцитов in vitro было в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих. Уменьшение количества лейкоцитов в пробах крови с однородным антигеном ППД–туберкулином для млекопитающих нельзя отнести к лейкопении, так как по существу лизис лейкоцитов произошел вне организма и лейколиз вызван усиленным разрушением сенсибилизированных лейкоцитов при воздействии специфического аллергена.

Определено, что при взаимодействии крови с ППД–туберкулином для млекопитающих процент лизиса лейкоцитов через 24 часа составлял 56%, через 48 часов - 72%, через 72 часа - 41%.

Затем количество лейкоцитов начинало повышаться и соответствовало норме через 672 часа.

В пробах крови с физиологическим раствором при введении десяти доз вакцины БЦЖ количество лейкоцитов стало повышаться через 24 часа. Наибольшее количество лейкоцитов in vitro зафиксировали через 96 часов после введения вакцины БЦЖ. Затем количество лейкоцитов медленно снижалось и соответствовало норме (число лейкоцитов в день введения вакцины) через 672 часа.

При повышении дозы живых микобактерий вакцинного шт. БЦЖ, увеличивается количество сенсибилизированных лейкоцитов, возрастает процент лизиса лейкоцитов и продолжительность реакции, этим характеризуется активность реакции специфического лизиса лейкоцитов.

Результаты в пробах крови с ППД–туберкулином для птиц и КАМ были практически одинаковыми с пробами крови, содержащими физиологический раствор, следовательно, РСЛЛ отсутствовала, что свидетельствует о специфичности реакции, так как лейкоциты не вступают в реакцию с чужеродными аллергенами.

У вакцинированных одной дозой противобруцеллезной вакцины шт. 82 кроликов РСЛЛ с ППД–туберкулином для млекопитающих, ППД–туберкулином для птиц, КАМ была отрицательной, так как в крови отсутствовали сенсибилизированные лейкоциты к этим аллергенам – диагностикумам. Количество лейкоцитов в пробах крови, содержащих туберкулин и физиологический раствор, у животных было практически одинаковым.

Отсутствие реакции лизиса лейкоцитов в пробах крови у вакцинированных животных вакциной противобруцеллезной шт. 82 , содержащих ППД–туберкулин для млекопитающих указывает на специфичность реакции, так как диагностикумы – аллергены не вступают в реакцию с сенсибилизированными лейкоцитами иного аллергена.

3.3. Исследование возможности использования РСЛЛ для дифференциации неспецифических реакций у коров, положительно реагировавших

на туберкулин

3.3.1. Исследование РСЛЛ крови у коров, положительно реагировавших

на туберкулин в Матвеево-Курганском районе

Диагностику туберкулеза реакцией специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) в производственных условиях выполняли в СПК «Рассвет» Матвеево-Курганского района, Ростовской области.

27 ноября 2006 г. на бойне СПК «Рассвет» был произведен комиссионный контрольно–диагностический убой семи коров, реагирующих на туберкулин, с последующим проведением послеубойной ветеринарно-санитарной экспертизы.

Перед убоем у коров взяли кровь для исследования реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ).

При исследовании установлено, что у трех (43%) коров реакция специфического лизиса лейкоцитов с ППД–туберкулином для млекопитающих, ППД–туберкулином для птиц и КАМ была отрицательной, т.е. процент лизиса лейкоцитов был равен 1% - 4%.

У четырех коров (57%) лизис лейкоцитов в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих составил 27%, 29%, 36%, 71%, тогда как РСЛЛ с ППД-туберкулином для птиц и с КАМ была отрицательной.

При проведении послеубойной ветеринарно-санитарной экспертизы семи реагирующих на туберкулин коров только у четырех (57%) были положительными показателями РСЛЛ в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих. У двух (29%) из них обнаружены изменения в лимфатических узлах, характерные для туберкулеза: у одной в подчелюстном, у второй в надартериальном лимфатических узлах. В тушах двух убитых коров (29%) с положительной реакцией на туберкулиновую пробу и положительными показателями РСЛЛ, патологоанатомических изменений, характерных для туберкулеза, во внутренних органах и лимфатических узлах визуально не обнаружено. Это, связано с недавним инфицированием животных возбудителем туберкулеза, поэтому патологоанатомические изменения еще не успели сформироваться. Кроме этого установлено, что положительные реакции на внутрикожное введение туберкулина с отрицательными показателями РСЛЛ в пробах крови с ППД-туберкулином для млекопитающих были у двух (29%) глубокостельных (7 – 8,5 мес. беременности) коров и у одной (14%) - с острым эндометритом.

У семи коров (100%) с положительной туберкулиновой пробой, РСЛЛ в пробах с ППД–туберкулином для птиц и КАМ отрицательна, т.к. сенсибилизация не вызвана птичьими и атипичными микобактериями.

3.3.2. Исследование реакцией специфического лизиса лейкоцитов крови

у коров в Сальском районе, положительно реагировавших на туберкулин

В производственных условиях диагностику туберкулеза РСЛЛ выполняли в ОАО «Южное», Сальского района, Ростовской области.

24 августа 2009 г. на мясокомбинате Песчанокопского района был произведен комиссионный контрольно–диагностический убой 32 коров, реагировавших на туберкулин, с последующей ветеринарно-санитарной экспертизой.

Перед убоем у коров была взята кровь для исследования в реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ). Результаты исследований по количеству лейкоцитов и показателям РСЛЛ у коров, с выраженной реакцией на туберкулин представлены в таблице №3.

Из 32 коров, реагировавших на внутрикожное введение туберкулина, только у восьми (25%) РСЛЛ была положительна при взаимодействии проб крови с ППД – туберкулином для млекопитающих. Процент лизиса составил у коров 19%, 20%, 23,1%, 23,8%, 24,5%, 30,2%, 31%, 32,7%.

Исследованиями установлено, что в пробах с ППД–туберкулином для птиц у восьми (25%) животных лизис лейкоцитов составил 14,3%, 15,8%, 20,1%, 21%, 23,1%, 23,8%, 27,3%, 34,5%.

У семи (22%) коров положительная РСЛЛ была с КАМ. РСЛЛ составила 19%, 20%, 23,2%, 23,8%, 24,6%, 28,6%, 33,3%.

Из них у шести (19%) коров положительная РСЛЛ наблюдалась как с ППД–туберкулином для млекопитающих, так и с ППД–туберкулином для птиц. У двух коров (6,3%) положительная реакция была на ППД–туберкулин для млекопитающих, ППД–туберкулин для птиц и КАМ. У восемнадцати (56%) животных, реагировавших на внутрикожное введение туберкулина, реакция специфического лизиса лейкоцитов была отрицательна во всех пробах крови.

Послеубойный осмотр туш и внутренних органов 32 коров, реагирующих на туберкулин, показал, что из восьми (25%) коров с положительными показателями РСЛЛ в пробах крови с ППД-туберкулином для млекопитающих, только у одной (3%) обнаружены в заглоточных лимфатических узлах изменения, характерные для туберкулеза, у двух (6%) – эхинококк в печени, у трех (9%) - стельность, у двух (6%) - стельность и эхинококк в печени.

Из 32 коров, реагирующих на внутрикожное введение туберкулина, у 14 (44%) были обнаружены эхинококковые пузыри в печени и у одной (3%) - в легких. В одном случае (3%) был обнаружен гнойный абсцесс в печени. Двадцать голов (63%) были стельные, из них четыре (13%) коровы были больны эхинококкозом, а у одной (3%) обнаружены туберкулезные изменения в заглоточных лимфатических узлах.

Таблица 3.

Количество лейкоцитов, показатели РСЛЛ и патологоанатомические изменения у коров в Сальском районе, положительно прореагировавших на туберкулин.

У семи (21%) из 32 коров, реагировавших на туберкулин, положительная реакция была в пробах крови с КАМ, что связано с инфицированием организма атипичными микобактериями.

Положительная реакция в пробах крови с ППД–туберкулином для птиц наблюдалась у восьми (25%) убитых животных, это объясняется с инфицированием коров микобактериями птичьего вида (M. avium).

Выявлены животные с положительной пробой на туберкулин, которые заражены несколькими видами микобактерий. Так, у четырех (12,5%) коров положительная реакция была в пробах с ППД–туберкулином для млекопитающих и ППД–туберкулином для птиц, у одной (3,1%) - с ППД–туберкулином для птиц и КАМ, у двух (6,3%) - с ППД–туберкулином для млекопитающих, ППД–туберкулином для птиц и КАМ.

Из 32 коров, положительно реагировавших на внутрикожное введение туберкулина, у 18 коров (56%) РСЛЛ в пробах с ППД–туберкулином для млекопитающих, ППД–туберкулином для птиц и КАМ была отрицательной, что связано с другими заболеваниями (эхинококкозом и т.д.) и стельностью.

Бактериологические исследования патматериала на туберкулез дали отрицательные результаты.

3.3.3. Исследование РСЛЛ крови коров в Неклиновском районе,

положительно реагировавших на туберкулин

В производственных условиях диагностику туберкулеза реакцией специфического лизиса лейкоцитов выполняли в СПК «Советинский», Неклиновского района, Ростовской области.

Восемь коров на ранее благополучной ферме положительно реагировали на туберкулин.

6 сентября 2009г. был произведен контрольно-диагностический убой коров, положительно реагирующих на туберкулин. При послеубойном осмотре патологоанатомических изменений во внутренних органах и лимфатических узлах визуально не обнаружено. Бактериологические исследования патматериала на туберкулез в Ростовской областной лаборатории дали отрицательные результаты.

Перед убоем, у коров, реагировавших на туберкулин, взяли кровь, для проведения реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ).

Установлено, что из восьми коров с положительными туберкулиновыми пробами только у двух РСЛЛ была положительна при взаимодействии проб крови с ППД–туберкулином для млекопитающих. Процент лизиса лейкоцитов у коров равен 10% и 16%.

У трех коров реакция специфического лизиса лейкоцитов была положительна с ППД–туберкулином для птиц. Лизис лейкоцитов у животных был 26%, 20%, 20%.

В пробах крови, содержащих КАМ, были получены отрицательные результаты РСЛЛ. Процент лизиса лейкоцитов составил от 0% до 2%.

У трех коров (37,5%), реагировавших на туберкулин, РСЛЛ во всех пробах была отрицательна.

У двух убитых коров (25%) с положительной туберкулиновой пробой и давших положительную РСЛЛ в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих, патологоанатомических изменений во внутренних органах и лимфатических узлах не выявлено, это связано с недавним инфицированием животных возбудителем туберкулеза, в связи с чем патологоанатомические изменения еще не успели сформироваться.

Положительная реакция в пробах крови с ППД–туберкулином для птиц наблюдалась у трех животных (37,5%), положительно реагировавших на внутрикожное введение туберкулина, у которых патологоанатомические изменения характерные для туберкулеза не обнаружены, что можно объяснить инфицированием коров микобактериями птичьего вида (M. avium).

Если сенсибилизация вызвана не туберкулезными микобактериями, то есть этиология сенсибилизации другая, то результаты РСЛЛ в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих будут отрицательными.

Возможность применения способа ранней диагностики туберкулеза in vitro на клетках крови непосредственно в практических условиях хозяйств будет способствовать широкому применению аллергенов различной природы в качестве средств дифференциальной диагностики специфических и неспецифических туберкулиновых реакций.

4. ВЫВОДЫ

1. Рабочая доза для реакции специфического лизиса лейкоцитов в пробе 0,1 мл исследуемой крови и 0,05 мл 3,8%-ного раствора цитрата натрия составляет 0,05мл для ППД–туберкулинов и КАМ.

2. У сенсибилизированных животных путем введении в организм животных живых микобактерий вакцины БЦЖ положительная РСЛЛ вне организма обнаружена через 24 часа после введением вакцины с аллергенами – ППД-туберкулином для млекопитающих.

3. Повышение дозы живых микобактерий вакцинного штамма БЦЖ животному сопровождается увеличением показателя РСЛЛ и продолжительности реакции, что свидетельствует о возрастании сенсибилизированных лейкоцитов и активности реакции специфического лизиса лейкоцитов.

4. В пробах крови с физиологическим раствором, ППД–туберкулином для птиц и КАМ у вакцинированных животных живыми микобактериями вакцины БЦЖ и в пробах крови с физиологическим раствором, ППД–туберкулином для млекопитающих, ППД–туберкулином для птиц и КАМ вакцинированных вакциной из штамма 82 количество лейкоцитов было одинаковым, то есть получена отрицательная РСЛЛ, что указывает на специфичность реакции, так как сенсибилизированные лейкоциты не вступают в реакцию с чужеродными аллергенами.

5. В реакции специфического лизиса лейкоцитов можно использовать много аллергенов, что позволяет дифференцировать неспецифические реакции на туберкулин.

6. Предлагаемый нами способ РСЛЛ дополняет и совершенствует комплекс существующей диагностики и дифференциальной диагностики туберкулеза животных.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Реакция специфического лизиса лейкоцитов позволяет обнаружить инфицированное животное в первые сутки после заражения, поэтому имеет большое практическое значение для ранней диагностики туберкулеза.

2. Рекомендуем для прижизненной дифференциальной диагностики специфических и неспецифических реакций на введение ППД–туберкулина для млекопитающих применять реакцию специфического лизиса лейкоцитов, что позволит уточнить диагноз на туберкулез и предотвратить неоправданный и необоснованный убой здоровых высокопродуктивных животных.

1. Дубовой, Б.Л. Новое в дифференциальной диагностике туберкулеза сельскохозяйственных животных / Б.Л. Дубовой, О.Н. Соловьева, Н.В. Улько // Сборник научных трудов «Диагностика, профилактика и лечение при инфекционных болезнях сельскохозяйственных животных».- Персиановский, 2000.-С.8-12.

2. Дубовой, Б.Л. Метод ранней диагностики туберкулеза крупного рогатого скота РСЛЛ / Б.Л. Дубовой, О.Н. Полякова // Ветеринарная медицина домашних животных.-Казань.-№3, 2006.–С. 54-56.

3. Дубовой, Б.Л. Поиск ранней диагностики туберкулеза животных / Б.Л. Дубовой, О.Н. Полякова // Международная научно-практическая конференция «Основные проблемы, тенденции и перспективы устойчивого развития сельскохозяйственного производства».-Махачкала.-Т.2, 2006.-С.68-69.

4. Дубовой, Б.Л. Исследования специфичности и активности РСЛЛ при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота / Б.Л. Дубовой, О.Н. Полякова // Инновационный путь развития АПК-магистральное направление научных исследований для сельского хозяйства.-Персиановский.-2007.–С.67-69.

5. Полякова, О.Н. Ранняя диагностика туберкулеза свиней / Полякова О.Н., Дубовой Б.Л.// Материалы межрегиональной конференции «Интенсивные технологии в свиноводстве: проблемы и пути решения».- Персиановский.-2007.-С.124-125.

6. Полякова, О.Н. РСЛЛ у дважды положительно прореагировавших коров на внутрикожную туберкулиновую пробу / О.Н. Полякова, Б.Л. Дубовой, Н.А. Соловьев// Материалы Всероссийская научно-практическая конференция «Актуальные проблемы функциональной и морфофункциональной диагностики болезней животных».-Новочеркасск.-2007.-С.179-180.

7. Полякова, О.Н. Изучение изменений активности туберкулина-ППД для млекопитающих РСЛЛ / О.Н. Полякова, Б.Л. Дубовой // Материалы Всероссийская научно-практическая конференция «Актуальные проблемы патологии морфологии и онкологии животных».–Новочеркасск.-2007.-С.74-75.

8. Полякова, О.Н. Реакция специфического лизиса лейкоцитов при диагностики туберкулеза животных / О.Н. Полякова // Материалы Всероссийская научно-практическая конференция «Проблемы, задачи и пути научного обеспечения приоритетного национального проекта «Развитие АПК».–Новочеркасск.-2008.-С.18-19.

9. Полякова, О.Н. Изучение неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота /О.Н. Полякова // Вестник Саратовского госагроуниверситета им.Н.И.Вавилова.-№6, 2008.-С.50-53.

10. Дубовой, Б.Л. Дифференциальная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота реакцией специфического лизиса лейкоцитов / Б.Л. Дубовой, О.Н. Полякова // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Повышение продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы на основе инновационных достижений».–Новочеркасск.-2009.-С.3-7.

11. Дубовой Б.Л. Способ ранней диагностики туберкулеза животных / Б.Л. Дубовой, О.Н. Полякова, А.И. Клименко, А.В. Коваленко, Л.П. Миронова // Изобретения. Полезные модели. Официальный бюллетень №25, 2009.-С.2.

12. Полякова, О.Н. Дифференциальная диагностика внутрикожных реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих (Тмл) у коров / О.Н. Полякова, Б.Л. Дубовой, В.В. Мосейчук // Материалы Международной научно-практической конференциию «Интеграция науки, образования продовольственной безопасности российской федерации».-Персиановский.-Т.№3,2010.–С.177-180.

13. Дубовой, Б.Л. Диагностика туберкулеза дифференциацией положительных внутрикожных туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота / Б.Л. Дубовой, О.Н. Полякова, В.И. Добрелин, В.В. Мосейчук, Г.В. Горячева // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарного обеспечения Российского животноводства».-Новочеркасск.-2010.-С.10-13.

14. Полякова, О.Н. Реакция специфического лизиса лейкоцитов при постановке дифференциального диагноза на туберкулез / О.Н. Полякова, Б.Л. Дубовой // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарного обеспечения Российского животноводства».- Новочеркасск.–2010.-С.8-9.

15. Дубовой, Б.Л. Диагностика неспецифических туберкулиновых реакций, вызванных атипичными и птичьими микобактериями /Б.Л. Дубовой, О.Н.Полякова // Ветеринария Кубани. – Краснодар.-№1, 2011. – С. 21-23.

16. Полякова, О.Н.Определение причин неспецифических туберкулиновых реакций ППД-туберкулином для птиц и КАМ вне организма /О.Н. Полякова, Б.Л. Дубовой // Ветеринария Кубани. – Краснодар.-№1, 2011. – С. 8-10.

Список сокращений :

1. 
   БЦЖ – сухая вакцина БЦЖ представляет собой высушенные живые микобактерии туберкулеза вакцинного штамма БЦЖ.
2. 
   КАМ – комплекс атипичных микобактерий.
3. 
   ППД для мл. – протеин пурифиед дериват для млекопитающих, представляет собой очищенную белковую фракцию, выделенную из культуральной жидкости возбудителя туберкулеза соответственно бычьего вида, выращенного на синтетической питательной среде.
4. 
   ППД для пт. – протеин пурифиед дериват для птиц, представляет собой очищенную белковую фракцию, выделенную из культуральной жидкости возбудителя туберкулеза соответственно птичьего вида, выращенного на синтетической питательной среде.
5. 
   РСЛЛ – реакция специфического лизиса лейкоцитов.

Полякова Ольга Николаевна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА ЖИВОТНЫХ.

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

Диссертации на соискание ученой степени

Кандидата ветеринарных наук

Подписано в печать 14.01.11 Печать оперативная

Объем 1 усл.печ.лист. Заказ № 198/1 Тираж 100 экз.

Издательско-полиграфическое предприятие

ООО "МП Книга", г.Ростов-на-Дону,

Таганрогское шоссе, 106